视黄酸受体基因在儿童胸腺中的表达与T淋巴细胞发育的研究

发布时间：2020-04-29 21:14

【摘要】： 维生素A(视黄醇)及其生物活性衍生物(retinoids,类维生素A)对细胞的分化、增殖、及胚胎的发育具有重要的作用。此外，维生素A对免疫系统的影响也日益被人们所关注。维生素A，尤其是其体内活性代谢产物视黄酸(retinoic acid，RA)，对T、B淋巴细胞均有作用，RA可显著促进金黄色葡萄球菌Cowan I株(SAC)活化后的脐血单个核细胞IgM的生成，但对成人外周血单个核细胞IgM的生成作用不明显，这提示在作用机制上存在随年龄增长或生长发育而异的特殊规律，但尚未见有关研究报道。研究表明，视黄酸通过与视黄酸受体(Retinoic Acid Receptor, RARs)结合调节基因转录，发挥其生物学作用。T淋巴细胞是组成免疫系统的重要的免疫细胞，在抗细胞内病原体感染以及辅助B细胞产生抗体的过程中均发挥重要作用，本研究通过观察视黄酸受体基因在胸腺表达及其与儿童T淋巴细胞发育的关系，探讨视黄酸对儿童T细胞的作用机制。 第一部分 视黄酸受体基因在儿童胸腺中的表达及意义 目的：胸腺是早期T淋巴细胞发育的重要场所，本研究旨在观察视黄酸受体六种亚型基因在儿童胸腺的表达分布规律，探讨其在儿童T细胞发育中的意义。 方法：采用地高辛素标记的反义RNA 探针原位杂交法，测定5岁以下儿童胸腺中视黄酸受体RARα、RARβ、RARγ， RXRα、RXRβ、RXRγ 六种亚型基因在mRNA水平的表达与分布；同期的连续冰冻切片还用免疫组织化学法测定CD1a、CD3的表达分布，分析视黄酸受体基因表达及分布与T淋巴细胞成熟的关系；并采用实时定量RT-PCR法对视黄酸受体基因在mRNA表达水平进行定量分析，了解视黄酸受体基因表达在儿童胸腺的变化规律。 结果：原位杂交结果显示，胸腺皮质及髓质均表达RARα、RARγ mRNA, 其中RARα mRNA在胸腺皮质区高表达；而RXRα、RXRβ mRNA主要在胸腺髓质表达，尤其在哈氏小体外周的细胞表达较高；胸腺中未检测到RARβ、RXRγ mRNA的表达。CD1a主要在胸腺皮质表达，而CD3在胸腺髓质表达，尤其在胸腺小体外周的胸腺细胞高表达。实时定量PCR分析结果显示RARα、 RXRα mRNA在出生后第一年高表达，1岁后表达下降。RARγ mRNA则随年龄增长表达增高，RXRβ mRNA在5岁以内变化不明显。 结论：视黄酸受体基因在胸腺中的表达随儿童的发育而变化，并且其表达变化与T细胞的成熟有关，不同受体亚型基因表达水平的调节在T淋巴细胞的发育 WP=5 中可能具有重要意义。 第二部分 视黄酸受体α基因表达与儿童T淋巴细胞发育的研究 目的：外周T淋巴细胞对维持正常的免疫功能至关重要，胸腺提供了T淋巴细胞发育分化所需的微环境。近年研究发现，一些核受体在T淋巴细胞的发育中发挥重要作用，视黄酸受体也属于核受体超家族，本研究通过对视黄酸受体α (RARα) 的活化或阻抑，研究其在儿童胸腺T淋巴细胞成熟分化中的作用及其机制。 方法：建立体外胸腺组织培养体系，在培养液中加入视黄酸受体活化剂-全反式视黄酸(atRA)或视黄酸受体拮抗剂-Ro41 5253。在培养的不同时间收集T细胞，用荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗体染色，，通过流式细胞仪分析，观察T细胞成熟分化表面标志的变化。同时，从T细胞中抽提的RNA采用实时定量RT-PCR法检测视黄酸受体α mRNA的表达。 结果：成功建立了体外胸腺组织培养体系，能够支持T细胞的发育成熟。在生理浓度的全反式视黄酸(atRA)条件下，培养24小时能明显促进未成熟的CD4+CD8+细胞向CD4+细胞分化，并且该作用可被RARα特异性拮抗剂Ro41 5253所拮抗。另一方面，atRA能抑制CD4+CD8+胸腺细胞向CD8+细胞分化，这种作用也在培养24小时出现。实时定量PCR结果显示，atRA能促进RARα mRNA的表达，该作用可被Ro41 5253所拮抗。RT-PCR发现胸腺基质细胞也表达RARα mRNA，实时定量PCR显示其RARα mRNA的表达量较胸腺细胞低。胸腺基质细胞在无atRA的情况下，RARα mRNA的表达无明显变化；加入atRA后在体外培养24小时胸腺基质细胞的RARα mRNA的表达开始升高，在48小时达高峰，与对照组相比差异有显著性(P0.05)，Ro41 5253能拮抗这种作用。 结论：胸腺细胞与胸腺基质细胞均表达视黄酸受体α基因，视黄酸受体α途径的活化在促进CD4＋细胞的发育中起重要作用。 第三部分 Notch-1信号途径在视黄酸影响T淋巴细胞发育中的作用 目的：Notch是一组跨膜受体，在多种器官及细胞的发育中起作用，主要决定细胞的分化方向。在哺乳动物中共发现四类Notch基因，编码四种Notch受体，分别为Notch1～4。近年研究表明，Notchs受体的表达与活化在淋巴细胞的发育中起重要作用。在Notch受体家族中，Notch1与T淋巴细胞的发育密切相关。 视黄酸对人胸腺细胞Notch1基因的表达有无作用，以及视黄酸对胸腺细胞发育的调节作用是否与Notch1途径有关，尚未见报道。本研究通过检测胸腺细胞发 WP=6 育过程中Notch1 mRNA的表达变化，并观察视黄酸对其表达的影响，初步探讨Notch1信号途径在视黄酸对T细胞分化发育中的作用。 方法：采用胸腺组织体外培养的方法，在培养中加入视黄酸受体活化剂-全反式视黄酸(atRA)或视黄酸受体拮抗剂-Ro41 5253。在培养的不同时间收集T细胞，用荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗体染色，?
【图文】：

胸腺的结构

19图 1-2.胸腺髓质(M)，HE 染色, 光镜×200.含胸腺小体(HC)，周围有上皮细胞( )，胸腺细胞( ) 。2. 儿童胸腺组织视黄酸受体 mRNA 的表达与分布我们对儿童胸腺组织采用原位杂交的方法，检测了 RARá mmRNA、RAR mRNA、 RXRá mRNA、 RXRa mRNA、 RXR mR
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【引证文献】

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1 任延利;齐德生;;维生素A在动物体内的作用机理研究进展[J];中国饲料;2008年08期

本文编号：2645008