睾丸蛋白表达谱的研究

发布时间：2020-04-30 04:16

【摘要】：睾丸作为主要的男性性腺器官,其主要功能是产生精子和分泌雄激素。精子发生是从未分化的生精细胞发育至精子的过程,其中包含了精原干细胞的有丝分裂,精母细胞经减数分裂产生单倍体的圆形精子细胞以及后续的圆形精子细胞向精子转变的精子变形过程。这些严格而复杂的程序化过程需要多种基因和蛋白质在不同发育时相精确协调地表达和调控,并且睾丸中很多蛋白表达都在翻译水平受到调节,为了更好的理解人睾丸的功能,在整体水平上对睾丸蛋白质表达谱进行鉴定并对其翻译调节进行研究有着重要的意义。我们使用一维琼脂糖凝胶电泳结合液相色谱分离后高级LTQ Orbitrap质谱鉴定的策略构建了人睾丸蛋白表达谱,共鉴定1430中蛋白质,其中有39个是睾丸特异表达的。对鉴定的睾丸蛋白表达谱进行结构域分析发现有三个大的蛋白家族:RRM蛋白家族、Rab蛋白家族和Arf蛋白家族。对RRM蛋白家族的通路注释显示该家族很多蛋白能调节剪接过程,它们可能与睾丸特异剪接的产生有关。对Rab和Arf两个蛋白家族的通路注释显示两者均与囊泡事件相关,可能参与顶体反应过程。另外,与脑组织表达的蛋白相比人睾丸蛋白表达谱中蛋白的研究相对比较局限,对睾丸蛋白表达谱中这些蛋白的深入研究可以帮助更好的理解睾丸功能。为了更好的研究精子发生,我们进一步构建了纯化的生精细胞的表达谱,由于人标本的限制,我们选择了最常用于研究精子发生的哺乳动物小鼠,使用流式细胞仪分别纯化了小鼠睾丸DNA含量分别为1C的单倍体生精细胞(1C生精细胞,精子细胞/精子)和4C的生精细胞(4C生精细胞),使用人睾丸谱系构建相似的策略构建了含有2116种蛋白的精子变形相关的精子细胞/精子蛋白表达谱和含有3507种蛋白的主要与第一次减数相关的4C生精细胞蛋白表达谱。在小鼠睾丸精子细胞/精子蛋白表达谱中有299个睾丸特异蛋白和157种新蛋白。对这些蛋白功能的生物信息学分析发现很多蛋白可能参与精子变形过程中的特异事件。对4C生精细胞蛋白表达谱的生物信息学分析发现表达谱中有216个蛋白是酵母减数分裂蛋白的同源蛋白,它们参与粗线期、DNA重组等细胞周期的各个事件,相互作用分析显示这些蛋白之间有复杂的调控关系。对两个表达谱的染色体定位分析显示蛋白在X染色体上分布均很少,可能是由于减数分裂后性染色体失活导致。两个表达谱的比较分析发现大部分精子细胞/精子中表达的蛋白在4C生精细胞阶段就已经开始翻译,这些蛋白中睾丸特异表达的主要与雄性配子发生相关。另外,只在4C生精细胞阶段鉴定到的蛋白主要与细胞周期相关,可能参与减数分裂调控,而只在精子细胞/精子阶段鉴定到的蛋白则主要与精子变形中明显的结构改变等事件有关。睾丸中蛋白表达有明显的翻译抑制现象,而最近很受关注的非编码小RNA家族的成员microRNA能通过多种机制调节蛋白质的翻译。通过分析哺乳动物全基因组microRNA的分布与进化,我们发现睾丸表达的成熟microRNA在X染色体上的进化速度快于常染色体。睾丸成熟的X连锁microRNA在小鼠和人之间的平均碱基替换速率大约是常染色体睾丸microRNA的25倍,而前体不在睾丸表达的成熟microRNA的碱基替换速率在常染色体和X染色体之间则没有显著的统计学差异。另外,睾丸表达的前体microRNA在X染色体上的进化速度也是快于常染色体的,这种睾丸表达的X连锁microRNA的快速进化现象广泛存在于包括啮齿类动物和灵长类动物动物在内的哺乳动物中。对睾丸表达X连锁microRNA靶基因的功能分析显示这些microRNA可能在精原细胞的有丝分裂和/或精母细胞的减数分裂过程中发挥着重要的作用,调节人睾丸蛋白表达谱中细胞周期相关蛋白,从而调节精子发生。我们对于人睾丸和小鼠生精细胞蛋白表达谱的大规模构建能够为将来研究男性不育,寻找可能的避孕靶点,以及发展睾丸癌治疗新方法提供一个非常丰富的资源。而对于睾丸表达microRNA的功能分析提示其在睾丸功能调节中可能有非常重要的作用,深入的研究能帮助阐释睾丸中蛋白的翻译抑制现象和更好的进行睾丸蛋白水平的研究。
【图文】：

亚细胞定位,博士学位论文,亚细胞分布,细胞定位

南京医科大学博士学位论文IPI00246975 GSTM3 2947 Glutathione S-transferase Mu 3IPI00304814 GPX4 2879Isoform Mitochondrial of Phospholipid hydroperoxideglutathione peroxidase, mitochondrial precursorIPI00020602 CSNK2A2 1459 Casein kinase II subunit alpha'IPI00031758 CHKB 1120 Choline/ethanolamine kinaseIPI00788782 ATP1A3 478 Na+/K+-ATPase alpha 3 subunit variant3. 人睾丸蛋白表达谱的 gene ontology 注释。我们使用 DAVID 软件[30]对鉴定的蛋白进行亚细胞定位分析。图 1 中显示的是鉴定蛋白的亚细胞分布，蛋白最多的定位是胞浆（27%），其次是未知细胞定位（16%），接下来是膜（14%）和核 (13%)。有些蛋白定位于细胞器，比如线粒体（7%），内质网（4%），，高尔基体（3%）和溶酶体（1%）。博士学位论文全文数据库 2011年第12期医药卫生科技辑 E059-

过程图,结构域,蛋白,细胞

23图 2. Pathway Studio 注释的被含有 RRM 结构域蛋白调节的细胞过程。椭圆形的为蛋白，方形的为被调节的细胞过程。蛋白与细胞过程间的调节关系用箭头表示，这些调节关系均是有参考文献支持的。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R341

【共引文献】