模式识别受体触发的巨噬细胞天然免疫应答调控的新机制研究

发布时间：2020-04-30 16:14

【摘要】：天然免疫是机体防御病原体入侵的第一道有效防线,病毒、细菌等致病性病原微生物一旦入侵机体,将迅速启动机体的天然免疫应答,触发炎症反应。在天然免疫细胞如巨噬细胞,树突状细胞等对病原微生物的识别过程中,Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为一种模式识别受体发挥着重要作用。TLRs特异性识别病原体中特定的分子结构,激活其下游的MyD88或TRIF依赖的信号通路,激活MAPK、NF-κB或者IRF3信号,最终激活天然免疫细胞产生炎症细胞因子和I型干扰素,构成机体免疫系统抵御病原体入侵的第一道屏障。MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类高度保守的长度约为21～23个bp的非编码寡聚核苷酸,其功能主要是通过与mlRNA的3’非编码区(3'UTR)特异靶位点相互作用从而负向调控aRNA的翻译。miRNA参与调控了多种生物学过程,如生长、发育、分化、肿瘤的发生等。同样,niRNA对免疫应答和免疫细胞的分化和功能也起着十分重要的调控作用。已有多篇关于miRNA参与调控天然免疫应答的相关报道,如miRNA-146、miRNA-101分别在炎症反应中起着负向和正向的调控作用。 miRNA-92a已被报道在肿瘤和血管生成方面起着重要作用,但其在天然免疫中的作用和意义未见报道。我们发现用多种TLR配体,如TLR2、TLR3、TLR4的配体LPS, PGN,PolyI:C分别刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞后,niR-92a的表达水平在短时间内下降。我们进一步检测了miR-92a在MyD88或TRIF缺失的巨噬细胞中经TLR配体刺激后的表达变化,发现niR-92a的表达下降同时由TLR信号途径中的MyD88,TRIF通路所诱导。之后,我们将合成的siRNA转染到巨噬细胞中,来模拟内源性miR-92a的功能或特异性抑制其作用来进一步研究niR-92a的功能。研究发现miR-92a的过表达可明显降低LPS诱导的炎症因子TNF-a和IL-6mRNA和蛋白表达水平,同时减低了JNK和C-JUN的磷酸化水平。相反地,抑制miR-92a功能后,巨噬细胞TNF-a和IL-6的表达增加,JNK/C-JUN信号通路增强。由于miRNA主要通过调控靶基因的表达进而发挥生物学功能,我们进一步通过miRNA靶点预测网站来寻找潜在的使niR-92a发挥上述功能的靶点分子。荧光素酶报告基因和蛋白检测等实验结果表明niR-92a可直接靶向抑制MKK4的表达,而MKK4是TLR信号中促进JNK活化的关键中间信号分子。接着,我们进一步证实了MKK4的功能,干扰MKK4后,JNK/C-JUN信号通路减弱,继而降低炎症因子TNF-a和IL-6的表达和分泌。综上所述,miR-92a在巨噬细胞TLR配体诱导的炎症反应中,可通过靶向抑制MKK4,从而降低JNK/C-JUN信号通路的活化,最终抑制炎症因子的表达。该研究结果为巨噬细胞炎症应答的调控机制增添了新的认识,并可能为炎症引起的免疫相关性疾病的诊治提供新的靶标。 TLRs(Toll—like receptors)是一类重要的病原分子模式PAMPs识别受体,在天然细胞如巨噬细胞,树突状细胞中广泛表达。TLRs特异性识别病原体中特定的分子结构,激活其下游的MyD88或TRIF依赖的信号通路,激活MAPK.NF-κB或者IRF3信号,最终激活天然免疫细胞产生炎症细胞因子和Ⅰ型干扰素。micrRNAs(miRNAs)是一种进化上保守的长约21～23个核苷酸的非编码RNA,其通过与靶基因的3’非翻译区间结合在转录后水平抑制靶基因表达。miRNA在生物体内发挥着重要的调控机制同样,同样对免疫应答和免疫细胞的分化和功能也起着十分重要的调控作用。由于在脂类代谢方面的关键作用,miR-33最近几年受到了研究者的广泛关注,但其在天然免疫中的作用和意义尚不清楚。我们发现用多种TLR配体,如TLR2、TLR3.TLR4的配体HKLM,LPS,PolyI:C分别刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞后,miR-33的表达水平在刺激后期下降。我们进一步检测了miR-33在MyD88或TRIF缺失的巨噬细胞中经TLR配体刺激后的表达变化,发现miR-33的表达下降主要受到TLR信号途径中的TRIF通路所调控。之后,我们将合成的siRNA转染到巨噬细胞中,来模拟内源性miR-33的功能或特异性抑制其作用来作进一步的研究。研究发现miR-33的过表达可明显增加LPS诱导的炎症因子TNF-a和IL-6mRNA和蛋白表达水平。相反地,抑制miR-33后,巨噬细胞TNF-a和IL-6的表达下降。胆固醇转运蛋白ABCA1和ABCG1被报道是miR-33的直接靶点,且其在炎症反应中起着负向调控的作用。由此,我们猜测miR-33可通过靶基因ABCA1和ABCG1对炎症起到调控作用。为此,我们首先验证了在原代巨噬细胞中,miR-33可直接作用于ABCA1和ABCGl,使其mRNA和蛋白水平下降。ABCA1-/-.ABCGl-/-小鼠来源的巨噬细胞中,过表达miR-33对炎症因子的正向调控作用减弱。同时,巨噬细胞内ABCA1和ABCG1的表达增加也减弱了miR-33对炎症因子的正向调控作用。接着,我们进一步研究了miR-33调控TLR触发的炎症应答的机制。ABCA1和ABCG1协同负责转运细胞内的胆固醇到细胞外,从而降低细胞膜内游离胆固醇的含量,进而影响脂筏的含量,抑制TLR信号的转导。因此,我们检测了miR-33对细胞膜脂筏含量的影响,结果发现miR-33可增加细胞膜内的脂筏含量,从而增强TLR信号,主要是NF-κB信号,最终促进炎症因子TNF-a和IL-6的表达和分泌。脂筏结构干扰化合物处理细胞后,miR-33对炎症因子的调控作用减弱,进一步验证了miR-33可通过调节细胞膜脂筏的含量来调控TLR触发的炎症应答。另一方面,miR-33也可抑制抗炎因子IL-10的表达,协同促进炎症因子的表达。综上所述,在巨噬细胞中,可能存在以下调控网络：LPS刺激后,TRIF信号通路可降低miR-33的表达,niR-33的下降释放了对靶基因ABCA1和ABCG1的抑制,从而促进细胞内游离胆固醇的外流,膜内脂筏含量降低,TLR信号减弱。另一方面,miR-33下降后,抗炎因子IL-10的表达增加,两者协同抑制炎症因子的表达。本课题的研究结果为巨噬细胞炎症应答的调控机制增添了新的认识,提示了胆固醇与炎症之间存在的关系,为炎症引起的免疫相关性疾病的诊治提供新的思路。 Interleukin9(IL-9)起初最为一种T细胞和肥大细胞的生长因子被研究者所认识。近十几年的研究揭示了IL-9更多的生物学功能以及产生机制,引起了研究者的广泛关注。初始CD4+T细胞在体外TGF-β和IL-4培养下能高分泌IL-9,分化成Th9细胞。 IL-9通过与IL-9受体结合发挥其生物学活性。IL-9能促进T细胞和肥大生长之外,对B细胞、固有淋巴细胞、单核细胞等的生长和功能也具有调控作用。IL-9能够促进LPS诱导激活的人巨噬细胞和单核细胞分泌TGF-p,并降低TNF-a的表达,从而抑制突发性氧化作用。IL-9也能抑制APC诱导的Thl型免疫应答。 IL-9在各类疾病的发生发展中发挥着不同的作用。在超敏反应和自身免疫性病中,IL-9作为一种炎症分子,能加速疾病的发展；而在寄生虫感染和皮肤移植中,IL-9能促进机体清除病原体以及移植物免疫耐受的形成。巨噬细胞作为炎症应答的主要细胞,在病原体感染和炎症反应中起着关键的作用。病原菌都有一些保守的特征性分子,称为病原菌相关分子模式PAMPs (pathogen-associated molecular patterns)。细胞表面的模式识别受体PRRs通过识别病原菌的PAMPs而激发免疫反应。一旦识别了病原体,PRRs就会激活其下游一系列的信号通路,活化天然免疫细胞产生炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素等细胞因子,从而启动天然免疫应答。而目前,IL-9对PAMPs诱导的巨噬细胞炎症应答的调控作用尚未清楚。因此,本研究的目的主要在于了解IL-9是否参与该过程,从而进一步了解IL-9在炎症疾病中作用。利用IL-9基因敲除小鼠,我们发现,IL-9-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞在各类PAMPs刺激下,炎症因子TNF-α,IL-6,IL-1β的表达显著下降。之后,我们单独用IL-9处理原代巨噬细胞,发现高浓度的IL-9能诱导原代巨噬细胞产生IL-6,TNF-α同时,用低浓度的IL-9处理能够增强原代巨噬细胞对PAMPs诱导的炎症因子的产生。可见,IL-9在巨噬细胞PAMPs激活的信号中发挥着一定的调控作用。我们正在进一步研究IL-9对巨噬细胞接受PAMPs刺激,活化TLR信号过程的调控效应及其细胞和分子机制,以及这样的调控方式在各类炎症和感染疾病发生发展中的作用,希望能为相关疾病的诊治提供新的方向和视角。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【共引文献】