地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡及其信息控制研究

发布时间：2020-05-01 10:15

【摘要】：第一章地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡体外模型建立及形态学研究目的：建立地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡体外模型并且进行凋亡形态学研究。方法：以地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型，通过流式细胞术、电镜和荧光显微镜测定模型的稳定性。结果：仅在完全RMPI 1640培养基培养条件下小鼠胸腺细胞自发凋亡百分率为(2.90±0.62)％，在2.5 μmol／L DEX诱导下，3小时培养组(12.70±2.44)％、6小时培养组(53.55±4.59)％发生了细胞凋亡；在1μmol／L DEX诱导下，小鼠胸腺细胞在3h、5h和7h凋亡比率分别为(18.43±0.30)％、(37.85±1.46)％和(62.53±1.81)％，对照组分别为(4.05±0.29)％、(4.81±0.24)％和(7.77±0.31)％，组间差异显著(p＜0.01)；相同时点下，DEX组坏死比率分别为(1.20±0.08)％、(3.99±0.31)％和(6.46±0.81)％，对照组分别为(0.93±0.10)％、(1.27±0.22)％和(1.55±0.19)％，组间差异显著(p＜0.01)。形态学和荧光显微观察到典型的细胞凋亡现象。结论：建立了体外DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡定量模型，并且发现影响模型稳定性的主要因素包括实验动物、温度、机械损伤和操作时间等。第二章地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中MAPK相关信息通路研究目的：研究在DEX影响小鼠胸腺细胞MAPK相关信号变化特点，以进一步探讨DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中的作用机制。方法：分别用终浓度为10、25和50μmol／L的ERK1／2特异性阻断剂PD98059(PD)以及10μmol／L的p38特异性阻断剂SB203580(SB)单独和联合1μmol／L的DEX作用小鼠胸腺细胞，并通过Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术测定3 h、5 h和7 h凋亡和坏死细胞比率；以终浓度1μmol／L的DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡，利用SDS-PAGE及Western blot检测0、30、60和180 min细胞内ERK1／2、p38、JNK1／2、c-Myc和caspase-3信号变化特点。结果：分别在终浓度10、25和50μmol／L的PD单独刺激下，小鼠胸腺细胞凋亡比例在3、5和7 h时点均显著高于对照组(p＜0.01)，而且表现出PD剂量依赖型诱导小鼠胸腺细胞凋亡趋势；各组坏死比例均高于对照组。在终浓度10、25和50μmol／L PD和1μmol／L DEX联合刺激下，小鼠胸腺细胞凋亡坏死进程明显提高，结果显示PD加速DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡。 SB10林mol/L单独刺激下，小鼠胸腺细胞凋亡比例在3、5和7h时点均显著高于对照组(p0.01);同时小鼠胸腺细胞坏死比例在3在相同时点下均高于对照组。SB10林mol几和1林mol/L DEX联合刺激下，小鼠胸腺细胞凋亡和坏死比例在3、5和7h时点分别为均高于DEX组。结果显示SB加速DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡 W亡stem blot结果显示，对照组胸腺细胞ERKI/2总量相对丰富而且稳定，基本上不随时间变化而变化，不仅如此，磷酸化激活的ERKI/2(pERKI/2)含量随时间变化也相对恒定。在DEX存在的条件下，ERKI/2总量相对有所下降，尤其是ERKI比较明显;pERKI/2含量在DEX的刺激后立即显著下降。对照组p38含量随着培养时间增加呈不明显变化趋势;而DEX组p38呈逐渐减少趋势。对照组JNKI随着时间变化呈逐渐增加趋势，而爪K2含量变化不明显。DEX 组每个时点州Kl/2含量均低于对照组，而且JNKZ呈明显的随培养时间延长而减少趋势。对照组在omin即可检测到c一Myc的明显表达，30min略见增多，lh和3h 呈微弱的下降趋势;而DEX组c一Myc在30 min明显增强，lh和3h显著减弱，但均高于对照组。对照组caspase一3在O和30 min表达不明显，而在lh和3h有着较为明显的表达;DEX组easpase一3在30 min最多，lh和3h显著减少。结论:本研究结果提示DEX对MAPK三种激酶表达和激活的阻断作用可能与其诱导凋亡有着密切的关系。在DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡呈现c一Myc介导的细胞凋亡模式，，而且在该过程中c一Myc、ERKI/2和casPase一3信号可能存在着反馈抑制调节的可能性。第三章地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中线粒体膜电势和钙离子变化研究目的:研究DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中线粒体膜电势(△平m)和钙离子 ([eaZ+]*)变化特点。方法:以终浓度1娜ol几的DEX刺激小鼠胸腺细胞，通过JC一1染色流式细胞术，在。、z、3、5、7、9、一l、24和27h时点分别检测小鼠胸腺细胞平均J一眼『egate (瓦2)和平均J一monomer(瓦l)含量，并计算线粒体膜电势(瓦2/瓦1)。利用激光扫描共聚焦分析测定细胞内[C扩勺i。利用cFDA一sE染色技术评价sh时点细胞骨架蛋白变化。结果:本研究中，小鼠胸腺细胞离体之后元1所反映的线粒体质量迅速下降，至sh对照组达到平台期(913.38士70.11)，然后缓慢下降到27h的(622.80士 22.81)。DEX组瓦l在lh和3h与对照组没有统计学差异(P0.05)，而从sh (660.91土72.95)开始显著低于对照组(P0.01)，并且随培养时间延长呈下降趋势，至27h的(309.70士53.35)。对照组和DEx组瓦2随培养延长而呈降低趋势。l一gh，对照组和DEX的△wm没有显著差异(P0.05)。而在11、24和27 h，对照组△wm分别为(256.41士21.59)、(214.14士23.21)和(146.14士17.97)，而
【图文】：

小鼠胸腺细胞,信号通路,组结,时点

tof叮oFand叮。护，“，‘toERK一瓜pathw叮ofmousethymoeDEXGF和aFGF27一54对DEx刺激下小鼠胸腺细胞ERKI/2信号aFGF27一‘54对p38信号的影响EX组结果见第三章图4.)54+DEX组和aFoF+nEX组p38在o一30min呈明显下显示出上升趋势，而且该时点p38含量显著高于Din的p38含量下降到与接近DEX组水平(图4.)。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

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