mRNA结构靶点筛选新方法RASS的研究

发布时间：2020-05-10 11:22

【摘要】：尽管反义核酸、Ribozyme、DNA enzyme以及双链RNA干涉小分子与mRNA分子在一级结构上严格按Watson-Crick碱基匹配原则互补配对发挥作用，然而能有效结合发挥作用的却是那些接近mRNA分子高度折叠结构的“靶点”的反义序列。本工作的主要目标是建立mRNA靶点的筛选方法，运用反义设计技术进行基因治疗和基因功能研究。首先，采用单链寡核苷酸随机序列文库，首次应用3’末端固定方法使mRNA在液相中的自然状态下与其进行杂交，通过洗脱、筛选，获得mRNA的结合文库序列，阐明mRNA全部结构靶点，建立了一种新的mRNA靶点筛选的分子生物学方法RASS(RNA accessible sites screening)。其次，用RASS方法和文献报道的MAST(mRNA accessible sites tagging)技术同时对模型基因--绿色荧光蛋白GFP的mRNA进行了靶点筛选，应用RASS获得GFP mRNA上3个结合靶点1，2，4，采用MAST方法获得了1，2，3和4等4个靶点，其中1、2、4与RASS的3个靶点完全相同。体外，4个靶点中1、2、4号靶点的反义核酸有效，2和4号的结合效果最好；细胞内1、2、4号的反义核酸明显而特异抑制了荧光蛋白表达，2号反义核酸突变2个碱基的对照组在体外体内均丧失了作用效果。对2号靶点设计了向5’和向3’移位的多条反义核酸(分别错位4个和8个碱基的反义核酸A2-8、A2-4、A2+4、A2+8)，实验表明，只有2号靶点反义核酸的作用效果最好，据RASS所设计合成的反义核酸序列准确，是最佳设计的反义核酸序列。 10-23DNA enzyme的体内体外作用活性和反义核酸组完全相同，四个靶点的2和4号靶点的10-23DNA enzyme切割效果最好，1号其次，3号效果不佳。细胞内抑制效果与之相同。10-23DNA enzyme的体外体内作用活性正确反映了反义核酸结合有效性，提出：10-23DNA enzyme可以作为体外评价mRNA结构靶点的工具。博}一学位论文论文摘要设计l小23DNA enzyme对照组时，如果突变错配的碱基位于切割位置的左右碱基使 10一23DNA enzyme突环结合能力降低，体外丧失了对mRNA的降解能力，但在细胞内仍抑制GFP基因表达，10一23DNA enzyme的结合臂序列发挥了反义核酸作用。10一23DNA enzyme对照组突变10一23DNA en即me两个结合臂中间碱基，使10一23DNA enzyme保留突环结合能力、降低两臂结合能力，则丧失了对mRNA的降解能力，细胞内也丧失了抑制 GFP基因表达。 !o一23DNA enzyme自身具切割mRNA的活性，用实验证明了10一23DNA enzyme的侧翼结合臂序列与RNA互补结合以后能发挥诱导RNaseH的酶促降解mRNA作用，认为 10一23DNA enzyme能产生比反以核酸更理想的基因抑制效果。证明DNA enzyme在细胞内具有双重活性，比反义核酸有更好的应用潜力。第三，将RAsS方法和MAsT方法、计算机软件RNAstructure3.71模拟方法对GFP的靶点，MAsT方法和RNAstructure3 .71模拟方法对小鼠Fas基因，兔p一globin基因片段的靶点进行了比较。 RNAstructure3.71模拟长度较短的基因靶点正确。据MAST技术获得的兔 (oryetolagus eunieulus)p一globin基因mRNA(属于122nt的小基因片段)的靶点2个，和计算机软件RNAstructure3.71模拟分析的位点，也和寡核普酸微阵列杂交技术筛选获得的靶点结果(NatazieM，1 997)完全一致。已经证明绿色荧光蛋白(GFP) mRNA4个结构靶点中2，4号是高效结合靶点，MAsT 技术获得了4号，但是它把2号靶点当作了低频率、低效靶点从而忽略了2号靶点，得到了3号无效靶点;RASS得到的靶点均有效，可能因为RNA“随机”标记技术导致了MAST 对有效靶点的忽视;而R了、55采用末端标记，能够获得全部有效靶点。 RNAstrueture3.71软件分析的靶点与GFP的4个靶点中有3个相同，约有50%一60%能被预测得到。MAST筛选了1 .skb小鼠Fas基因2个靶点(1，2)，只有一个最有可能被 RNAstructure软件预测分析得到(靶点2)，尚有许多其它可能的靶点。软件分析模拟推荐的结构靶点较多，随着基因长度增加计算机软件分析确认靶点的难度增大，预测的靶点需要实验验证，但是它对实验筛选靶点、设计反义核酸有辅助价值。RAss和MAsT等实验筛选方法能筛选各种长度基因mRNA的靶点，比软件预测具有简单、快捷和有效的优，点。博卜‘学位论义论文摘要第四，由于RASS和MAST方法在应用中，需要一条一条地测定成百条序列，1次测序反应获得1条文库小片段序列，测定过程繁杂，消耗大量人力和物力，不利于其在普通实验室推广应用。本研究自行建立了两个专利方法，其一采用小序列酶切、连接、克隆测序，其二通过设计搭桥引物、扩增达到连接而完成连接测序的目的。文库小片段序列通过连接进行测序，，1次测序反应可以获得8至20条文库小片段序列，其费用约为原始方法的二十分之一至八分之一。此方法快速而经济，能满足普通实验室应用凡ASS， MAS’I’筛选靶点的需求。
【图文】：

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图1.RASS技术筛选靶点原理简图2图3图4图6基因的PCR扩增1.6kbP;图3.IA6基因转录得到的cRNA8oobp扩增产物6ObP;图5.文库序列的扩增产物插入T载体的阳性DNA标准分子量采用TAKARA公司的DLZoo0Marker分别为:。)

模板,产物,学位论文,GFP基因

博卜学位论文第二部分结果GFP基因转录模板DNA和eRNAPCR扩增得到75obp大小的GFp基因转录模板DNA和cRNA(图2，3)，产物两端分别被引入了T3启动子序列和PolyA序列。以此产物为模板，在T3RNApolymerase的作用下，37oCl.sh后可获得优质的RNA(图3)，此RNA产物的末端为PolyA。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

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