GLIPR-2促进Ⅱ、Ⅲ型EMT的作用和机制研究

发布时间：2020-05-10 13:22

【摘要】：上皮向间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞在某些生理或病理条件下失去上皮特性转变为间充质细胞的现象，EMT过程中不但有细胞表型的变化，而且包括细胞标志物的改变：失去上皮细胞标志物，如钙粘附蛋白(E-Cadherin，E-Ca)；获得间质细胞标志物，如波形蛋白(Vimentin，Vim)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)。此外，伴随着EMT的发生，细胞还出现形态改变、迁移能力增加等变化。Kalluri R等依据EMT的发生条件和所导致的结果不同将其分为三种类型:在胚胎形成和器官发育过程中所发生的EMT被归类为Ⅰ型，此型EMT既不引起器官纤维化也不引起细胞侵袭转移，其结果是细胞经过间质向上皮转化再次转变为上皮细胞；在组织修复和器官纤维化过程中所发生的EMT被归类为Ⅱ型，此型EMT主要是由于慢性炎症长期刺激使上皮细胞向间质转化，进而分泌胶原成分并最终导致器官的损害；在肿瘤的发生、发展和癌细胞的转移、侵袭过程所出现的EMT被归类为Ⅲ型，这一类型EMT主要原因是癌细胞遗传基因改变或是细胞不可调控的生长方式，最终导致癌细胞的侵袭和转移。EMT的发生受到多种基因和生长因子的调控，如Twist基因、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-β)等均可以诱导EMT发生,也可以引起细胞的增殖,这取决于局部微环境与信号分子之间的相互作用。目前研究发现大多数生长因子,如EGF可以通过与其受体相结合，激活受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs),进而促进EMT过程。由此可见，深入研究EMT发生机制、并有效阻抑EMT进展对器官纤维化和实体瘤转移等相关疾病的治疗非常关键。神经胶质瘤致病相关蛋白-2(Glioma pathogenesis related-2，GLIPR-2)属于PR-1蛋白家族(pathogenesis related-1，PR-1)，编码序列为465bp，蛋白分子量大小约为17KD，该基因在人体仅表达在外周血单核细胞、脾脏和肺脏。Ruth M. Baxter等曾报道GLIPR-2基因在奥尔波特(COL4A3基因敲出)小鼠的肾脏中表达增高，其蛋白可以作用小鼠肾小管上皮细胞下调上皮细胞标志物E-Ca的表达，提示GLIPR-2在EMT过程中有着重要的作用。本课题组的研究发现，GLIPR-2在糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN，Ⅱ型EMT)的肾小管上皮细胞和肝癌组织(Hepatocellular carcinoma，HCC，Ⅲ型EMT)的局部特异性表达，表明该基因可能参与了Ⅱ、Ⅲ型EMT过程。但是，GLIPR-2促进EMT的机制和治疗学意义尚需深入探讨。目的检测GLIPR-2在糖尿病肾病和原发性肝癌组织标本中的表达并探讨促进GLIPR-2上调的因素，，分析其与EMT的作用关系及相关信号通路，以期阐明该基因促进EMT机制，为器官纤维化和实体瘤转移等相关疾病的治疗提供新的思路。方法 1.利用免疫组化技术首先检测正常肾脏和糖尿病肾病肾组织标本、正常肝和原发性肝癌组织标本中GLIPR-2的表达差异；用含浓度为5、10、20、30mM葡萄糖的DMEM低糖培养基培养近端肾小管上皮细胞株HK-27天，在缺氧条件下培养肝癌细胞株HepG2细胞72h，利用逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和蛋白质印迹(WesternBlotting)技术检测不同时相点GLIPR-2核酸和蛋白水平的变化，探讨促进GLIPR-2上调的因素。 2.利用基因转染技术建立稳定表达GLIPR-2基因的HK-2细胞和对照组细胞，采用生物信息学预测候选相关的靶基因，并进一步利用Western Blotting和qRT-PCR对报告基因实验进行实验验证。 3.建立瞬时表达GLIPR-2基因的HepG2细胞和对照组细胞，用免疫荧光、real-timeRT-PCR及Western Blotting技术检测EMT相关标志分子物表达的变化，并进行相关信号通路的检测确认。 4.采用Transwell实验检测对照组细胞和实验组细胞侵袭与迁移能力的改变。 5.采用siRNA干扰技术，在缺氧条件下抑制GLIPR-2基因在HepG2细胞的表达，再检测对照组和干扰组细胞EMT相关分子标志物和侵袭与迁移能力的变化，以进一步确认GLIPR-2与EMT的关系。结果 1.免疫组化染色结果显示，GLIPR-2在正常肾组织中没有表达而在糖尿病肾病(Ⅱ型EMT)组织的肾小管上皮细胞中特异性表达，同时与对照组比较EMT相关分子标志物E-Ca在糖尿病肾病组织的肾小管上皮细胞表达下调、而Vim和α-SMA在其中表达上调；体外实验证实，5、10、20、30mM葡萄糖作用7天后GLIPR-2的表达量随葡萄糖浓度的增加逐渐升高，20mM葡萄糖作用7天后GLIPR-2的表达量随时间的延长而升高；GLIPR-2在正常肝组织中没有表达而在肝癌组织(Ⅲ型EMT)的部分区域中特异性表达，在缺氧条件下的肝癌细胞株HepG2中，GLIPR-2的表达量随时间的延长而增加。 2. EMT芯片(对照组细胞和转染GLIPR-2的HK-2细胞)筛选获得了多个与EMT相关的差异表达基因，qRT-PCR验证的结果与芯片一致；Western Blotting和qRT-PCR结果显示，与对照组相比转染GLIPR-2的细胞中上皮细胞标志物E-Ca的表达明显上调，间质细胞标志物Vim和α-SMA的表达明显上调。 3.与对照组相比转染GLIPR-2后，近端肾小管上皮细胞株HK-2和肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力明显增高。 4.磷酸化ERK1/2通路参与了GLIPR-2促进EMT过程。根据芯片结果中EGFR基因表达上调的提示，其下游的ERK1/2通路可能与EMT相关。转染GLIPR-2后，实验组的磷酸化ERK1/2水平升高，磷酸化ERK1/2特异性阻断剂PD98059可明显抑制GLIPR-2诱导的EMT表型和迁移能力的变化。 5.采用siRNA干扰技术，在缺氧条件下HepG2细胞中抑制GLIPR-2表达，可明显抑制EMT表型和迁移侵袭能力的变化。结论 1. GLIPR-2在糖尿病肾病组织中的肾小管上皮细胞特异性表达，高糖条件可以促使GLIPR-2在HK-2细胞中表达； 2.通过EMT芯片和Western Blotting分析发现，GLIPR-2在HK-2细胞中表达可以活化ERK1/2磷酸化依赖通路促进EMT过程，并伴随着细胞迁移能力的增加； 3. GLIPR-2在肝癌组织中局部特异性表达，缺氧微环境是可以使HepG2细胞中GLIPR-2的表达增加； 4. GLIPR-2在HepG2细胞中表达同样可以通过增加p-ERK水平进而促进EMT的发生并使肝癌细胞迁移和侵袭能力增加； 5.缺氧条件下抑制GLIPR-2的表达，可以明显阻抑EMT的发生，进而阻断肿瘤细胞的迁移和侵袭，将GLIPR-2作为防治肿瘤细胞转移提供新的靶点。总之，本研究首次发现GLIPR-2可以通过磷酸化ERK1/2通路促进EMT的发生，抑制该基因的表达，可以阻抑EMT的发生，为防治器官纤维化和实体瘤的转移及相关疾病提供了新的思路。
【图文】：

糖尿病肾病,博士学位论文,小管,显微镜观察

第三军医大学博士学位论文皮细胞发生了 EMT 现象；而 GLIPR-2 和 p-ERK 在糖尿病肾病的小管，该基因可能通过磷酸化ERK1/2 通路促进了EMT 的发生。

培养基,细胞,葡萄糖,表达水平

第三军医大学博士学位论文高糖诱导 GLIPR-2 在 HK-2 细胞表达糖浓度为 20 mM 的 DMEM 低糖培养基培养 HK-2 细胞 4 d，经2 的 mRNA 表达水平升高(图 2)；Western Blotting 结果显示，20、30 mM 的培养基培养 HK-2 细胞 7 天后，GLIPR-2 蛋白水而逐渐增多(图 3)；葡萄糖浓度为 20 mM 的培养基培养 HK-2白表达水平随时间的增加而逐渐升高(图 4)。这说明高糖诱导表达。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【共引文献】