EBV易感转基因小鼠动物模型的建立

发布时间：2020-05-12 16:37

【摘要】： 细胞恶变是一个非常复杂且受多种因素影响的过程，除了EB病毒感染外，鼻咽癌的发生还与遗传因素、环境因素以及生活习惯等有关。随着研究的深入，EB病毒在NPC发生、发展中的作用日益受到重视。 EB病毒感染的宿主范围极其狭窄，仅能感染人及少数几种灵长类动物。病毒感染的靶细胞主要有两种：B淋巴细胞和复层鳞状上皮细胞，B细胞源性肿瘤如伯基特氏淋巴瘤和免疫母细胞性淋巴瘤、上皮细胞源性肿瘤如鼻咽癌均与EBV感染密切相关。EBV感染B淋巴细胞的途径已十分清楚，B细胞表面存在EB病毒受体CR2，CR2原为补体C3d的受体，因EB病毒主要壳膜糖蛋白gp350/220的分子结构与C3d高度相似，故可经过该受体进入细胞。 EB病毒如何进入上皮细胞，其机制至今未明，可能通过以下途径：(1)通过与上皮细胞表面的CR2受体结合；(2)作为免疫复合物的一部分进入被感染细胞；(3)通过产病毒细胞与上皮细胞间的直接接触或与粘膜细胞融合而感染上皮细胞；(4)在辅助因子/辅受体的帮助下感染细胞，或在辅病毒的帮助下转变为能感染上皮细胞的假型。在研究EBV与NPC关系中最常遇到的问题就是，在体外培养过程中EBV不能直接感染人正常上皮细胞，更谈不上转化上皮细胞，从而构建出具有代表性的NPC细胞系。寻求建立EBV易感的适当细胞及整体动物模型一直是研究者们追求的方向。本研究在这方面进行了尝试，借助于转基因技术将病毒受体基因导入小鼠鼻咽部上皮细胞，以期能建立近似于自然感染EBV的小鼠动物模型，为研究EBV与NPC的关系奠定良好的实验动物基础。本文进行了如下研究: (一)转基因载体的构建:PCR法扩增ED一L2启动子，利用基因重组技术，分别构建pEDLZ一hCRZ/PEDLZ一p工gR上皮特异性表达载体，经限制性内切酶鉴定及测序证实获得目的基因正向插入克隆; (二)转基因载体体外转染实验及载体特异性分析:利用脂质体法分别将pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一p工gR两种载体转染人表皮细胞HaCaT和小鼠鼻咽上皮细胞TMNE，建立了稳定表达上述两种受体的克隆细胞，通过 RT一PCR和免疫组化方法证实目的基因在宿主细胞内转录和蛋白质表达水平均正确。同时还瞬时转染了人胚肺细胞Wl一38、人结肠腺癌细胞LOVO 和鼠成纤维细胞NIH3T3，目的基因在W工一38及NIH3T3细胞内不表达，在LOVO细胞内的表达水平，与转染空载体及空白对照细胞基本一致，提示ED一L2启动子在宿主细胞内能正确调控目的基因的表达。 (三)体外病毒感染实验:对稳定转染CRZ/plgR的HaCaT、TMNE细胞，在体外培养过程中分别用EBV、EBV+TPA及T以处理，两种受体阳性细胞EBV/EBV+T以处理组均能感染上病毒，PCR及Southern Blot能检测到EBV BamHIW片段，EBER一1原位杂交阳性，感染率在18.96%一32.82 %之间，病毒对HaCaT细胞的感染率明显高于TMNE细胞(P0.05)。电镜下在TMNE一CRZ/T MNE一plgR细胞内均找到病毒颗粒，确证目的蛋白 CRZ/p工gR在鼠源性TMNE细胞内也能正确发挥其生物学功能。转染受体的TMNE细胞在体外能感染上EB病毒，直接提示携带EB病毒相关受体的转基因鼠，其鼻咽部上皮是完全有可能感染上EB病毒的。 (四)CRZ/plgR转基因小鼠的建立:将pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一plgR载体双酶切后，仅保留启动子+目的基因片段，通过显微注射的方法，分别注射入小鼠受精卵，注射后受精卵的成活率约40%~50%，，移入假孕母鼠体内，约6%左右的移植胚胎可以发育正常足月，产下CRZ、plgRFO 代鼠28、47只，PCR检测分别有11、15只阳性，Southern Blot分析各有4、6只鼠阳性，阳性率分别为14.28%、12.77%。plgR FO代southern 杂交阳性鼠雌雄交配或与正常鼠合笼，产下plgRFI代鼠71只，PCR检测23只阳性，Southern杂交7只阳性，阳性率为9.86%。分别处死 Southern杂交阳性CRZ FO及plgR FO/FI代转基因鼠各1只，免疫组化一6- 显示目的蛋白在p工gRFO代转基因鼠的鼻咽、食道上皮能正常表达，气管、胃、肠、肾等上皮无表达;但目的蛋白在CRZFO、plgRFI代鼠鼻咽、食道和舌头上皮无明确表达。对Southern Blot鉴定为阳性的鼠，用EBV+TPA隔日滴鼻处理，最长时间达3个月，未能观察到小鼠感染上 EBV，ELISA检测转基因鼠外周血EBV一IgG均呈阴性。本实验首次建立了鼻咽部特异性表达EB病毒受体的转基因鼠，虽未能观察到动物感染上了EB病毒，但我们的实验在EBV易感动物模型方面进行了有益的尝试，如能对实验进行进一步的改进，也许在不久的将来将会取得突破。
【图文】：

连接酶

pEDLZ质粒构建示意图

质粒,双酶

123质粒分别经EeoRI+Hindlll、产物条带大小正确，见图4、123—pLXSN—hCRZ图4，pLxSN质粒用EeoRI+Hindlll双酶t)J鉴定1，pLXSN质粒/EeoRI单酶切;2，Marker:入一DNA/Hindlll;3，pLXSN/EeoRI+Hindlll双酶切一28-图5，pLXSN一hCRZ质粒用Hpal酶切鉴定l，pLXSN一hCRZ质粒/Hindlll酶切;2，Marker:人一DNA/Hindlll;3
【学位授予单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R-332

【参考文献】