钩端螺旋体致病相关基因的鉴定与功能研究

发布时间：2020-05-12 22:10

【摘要】： 本实验是在中国人类基因组南方研究中心2001年10月份完成我国境内问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株#56601(Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar lai type strain #56601)(强毒株)全基因组测序的基础上开展的。在部分参与基因注释过程中，发现一系列和致病相关的基因，如黏附和侵袭相关基因、鞭毛基因、运动／趋化相关基因、LPS合成相关基因、信号传导基因、与溶血、贫血、黄疸相关的溶血素基因、与出血相关基因、调节菌体生长状态的凋亡基因等等。致病性钩端螺旋体全基因组所揭示的独特的生理学和病理学特征发表在2003年4月24日出版的Nature杂志，其中与溶血、出血、菌体凋亡相关的部分基因功能的研究结果来自本实验。 钩端螺旋体(Leptospira)是一种呈细长丝状、圆柱形、螺旋盘绕规则而致密的螺旋体，它需氧、运动活泼，是一种既能在体内生长、又能在体外培养的微生物，在世界范围引起人兽共患病—钩端螺旋体病。其体外生长受到很多因素的影响。较适宜的培养基为EMJH和Korthof培养基，但生长缓慢(需40～50个小时达到对数期)，菌浓低。幼龄豚鼠感染实验证明：体外培养的有毒株仍然具有强致病性，无毒株无致病力，两者在毒力方面有显著差别。 利用生物信息学手段首次预测钩端螺旋体染色体共编码了十个溶血素基因，其中九个未知，分为两大类，即鞘磷脂酶类(LA1027，LA1029，LA3050，LA4004)和非鞘磷脂酶类(LA0327，LA0378，LA1650，LA3937，LA0150)。在原核系统中克隆、表达并纯化了其中八个溶血素基因，血平板“热-冷孵育”法鉴定了这些蛋白的溶血功能。薄层层析法和高效液相色谱法进一步鉴定LA1027，LA1029，LA3050和LA4004的鞘磷脂酶活性。如此众多的溶血素基因同时编码于同一个染色体上，这在微生物界是首次发现。 RT-PCR实验证明溶血素基因在钩端螺旋体中都转录；Western-blot实验证明在EMJH环境下，大多数溶血素基因都表达(LA1027不表达，LA3050只在有毒株中表达)，而且和毒性无关；ELISA实验证实多数溶血素蛋白均能被分泌到菌体外，分泌量和毒力相关(其中LA1027和LA0378几乎为零)。 钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素LA1029和非鞘磷脂酶类溶血素LA3937均对细胞有显著的毒性作用，致使细胞绒毛消失，细胞膜破裂或完全消失，胞质外漏，胞桨染色变浅，细胞器肿大、外溢、丢失，细胞核出现空泡，细胞染色质凝集，甚至核膜边缘不整齐，有破裂，细胞坏死现象严重。大量的细胞碎片黏附在为数不多的完整细胞表面。部分肝细胞出现典型的细胞凋亡现象，如线粒体肿大，细 沈阳药科大学博仁学位论文 摘要 胞核边聚、浓缩、有多个核结构，裂解为核小体。流式细胞术检测发现LA 1 029 能诱发14.73%一57.92%的肝细胞发生凋亡，，但是不能诱发肾细胞293凋亡; LA3937能引发肾细胞周期改变。人cDNA array结果表明LA1029能显著改变肝 细胞的表达谱，其中90个基因的表达发生显著变化，上调基因10个，下调基因 80个，这些基因主要分布在与肿瘤发生、信号转导、细胞凋亡、细胞周期、代 谢、蛋白质合成等方面，说明 LA 1 029能引起组织细胞的多种病理改变。此外， 溶血素LA 1 029能刺激细胞分泌炎症介导因子IL一lp和IL一6。说明钩端螺旋体溶 血素即能引起严重的细胞坏死，也能引起细胞凋亡，和钩体病患者的组织器官炎 性反应、发热、功能障碍、衰竭有直接关系。 钩端螺旋体染色体还编码一套可能和出血病症相关的基因，包括1个溶菌酶 基因(acm)，1个胶原酶基因(colA)，17个Yer6’inia YopM蛋白基因(，勿，卿、 l个血小板激活因子乙酞化酶基因切旷ah)、2个类似于von Willebrand faetorA domain的基因(vwA了，v砂月2)。这些基因除了vwAZ之外均转录，由此推测构建 一副出血模型图。 以牛脑胞内PAF一AHI型蛋白Y亚基1认AB(PDB数据库编号)为模件，计 算机模拟出钩端螺旋体队F一AH(LAZ 144)蛋白的立体结构，发现它们极其相似， 酶催化位点(ser“’一Hisz08一Asp20，)保守。检测菌体和培养上清液中队F一AH酶活 性，发现其不分泌到细胞外，可能是一种胞内酶。Westom一blot显示队F一AH表 达量与毒性相关。克隆、表达并纯化重组蛋白PAF一AH，发现其米氏常数Km同 正常人血清Km，血小板凝集实验进一步证明重组PAF一AH具有阻止血小板聚集 的生物学活性。比较血清队F一AH酶活性，发现黄疽出血群患者酶活性显著高于 正常人和其他型钩体病患者，推测这可能是由于毒力株黄疽出血群钩体释放了大 量PAF一AH到人体血液系统中，灭活宿主体内血小板激活因子(PAF)的生理活 性，使血小板不能勤附、聚集到毛细血管微小受损处，不能分泌众多凝血因子， 从而妨碍宿主的止血及凝血，导致大出血症状，是钩端螺旋体出血症状的重要致 病因子之一。 比较基因组分析，发现钩端螺旋体编码了一对紧密联系的基因座vopBc loci， 该基因与其他微生物中的同类基因在氨基酸序列和操纵子结构上相似。在大肠杆 菌表达系统中单独表达v即刀、vopc基因，发现vopC基因产物抑制菌体的生长， 同时表达vaPB和vaPc基因时，菌体生长正常。这种现象与现
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20%一30%鞘磷脂成分，它们可以被鞘磷脂酶水解而发生溶血，因此上述蛋白被命名为鞘磷脂酶类溶血素。将己知的鞘磷脂酶溶血素SP17627和预测的鞘磷脂酶溶血素结构域种类、分布进行比较，结果见图1一8。同时比较上述蛋白在结构域内的氨基酸序列相似性，结果见表1一4。0100200300400500卜钊.一叫叫训叫喇呻材州咐闷材一叫引引喇.一妇喇中一叫喇叫喇喇中P17627556aa鞘磷脂酶类济血素各结构域功能说明F19.1一吕Domaint’UnetionalanalysisofPutativesPh一ngomyelinase一likehemolysin图1一8预测的鞘磷脂酶类溶血素蛋白结构域分析表1一4鞘磷脂酶类溶血素与5P17627在各结构域相似性比较(相同性，相似性，%)GenCIDP17627LA1027PD133144PD011673PD447657PD041204100，100100，10061，76100，10071，78100

使用PCR方法从钩端螺旋体赖株染色体上扩增溶血素基因的相应片段，PCR引物、扩增体系以及扩增反应程度见实验方法。溶血素扩增片段的大小以及重组表达的蛋白分子量、PI等信息见表1一5，PCR扩增结果见图1一16。将扩增成功的基因片段进行DNA测序，确定它们与原基因组序列一致后，按照实验方法操作，将其重组到质粒pET28b(+)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLys中进行表达。表1一5No·oeneInpCRProduet(bP)体外克隆、表达溶血素重组蛋白的分子量a.a.net-PInet-M.W.his一Ihis一M.W.StabilityS

本文编号：2660914