两种蝮蛇毒类凝血酶基因的克隆表达与分离纯化

发布时间：2020-05-16 12:37

【摘要】： 本文通过对已知蛇毒类凝血-酶基因的核苷酸序列进行同源性分析研究，根据同源性极高的上游信号肽保守区域设计合成四条寡聚核苷酸引物，以提取的大连蛇岛蝮蛇(Gloyclius shedaoensis)毒腺总RNA为模板，RT-PCR方法合成扩增其中的类凝血酶基因序列，以设计的内侧引物为引物，进行二次PCR，，对此PCR产物双向测序得到该类凝血酶基因的全序列并由此推测出相应的氨基酸序列，基于与不同来源的类凝血酶基因同源性分析比较，推测出该类凝血酶的催化残基为：HiS~(43)，Asp~(88)，Scr~(182)和Asp~(176)；六对二硫键为：Cys~(7-141)，Cys~(28-44)，Cys~(76-234)，Cys~(120-188)，Cys~(152-167)，和Cys~(178-213)。与其它已知的类凝血酶不同，大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶只含有一个糖基化位点，即Asn~(100)-Ser~(101)-Thr~(102)。以同样的方法，得到长白山白眉蝮蛇(Gloydius ussuriensis)毒类凝血酶基因，并比较了它与大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因序列的差别，发现两者的同源性高达98％，只有三个氨基酸不同：Gln~(66)．Glu~(66)；Gly~(117)vs．Asp~(117)；Thr~(225)vs．Ile~(225)。由于天然形式存在的两种酶活性差别较大，说明这三个氨基酸疏水性的改变对酶的高级结构产生了影响。两种蛇毒类凝血酶的cDNA序列及推导的氨基酸序列均为首次报道，并已申请了专利保护。这两类蛇毒类凝血酶基因的成功测序为其基因工程及其结构和功能的研究创造了条件。 将大连蛇岛蝮蛇和长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶基因分别克隆到大肠杆菌表达载体pET-32(a)+中，在T7启动子下表达出融合蛋白，融合部分为硫氧还蛋白，位于类凝血酶基因上游，并在其N端带6xHis Tag标签以利于表达产物的分离纯化，经热激转化至宿主菌BL21(DE3)中，IPTG诱导斗小时后收获菌体。经SDS-PAGE，亲和层析及电镜分析，表达产 摘 蛰 物主要以可溶性的蛋白质形式存在于细胞质中。 首次将大连蛇岛赅蛇毒类凝血酶成熟基回克隆到表达载体pPICgK 中，经电激转化至毕氏酵母菌株GS15 中，再经甲醇诱导，在150ml摇 瓶畔1获得细胞外分泌表达产物。对菌体培养条件进行的探索表明：蛋白 表达的最佳pH值应为6刀，最佳诱导时问为36小时，培养基为营养丰 富的复合培养基。表达产物的活性趣过检测其精氨酸酯酶活性和纤维蛋 白原的凝结活性确定，表达量通过精氨酸酯酶活性估算约为4mg／l（培养 液）。 为研究重组类凝血酶的纯化方法，选取含大连蛇岛蝗蛇类凝血酶基 囚的毕氏酵母，其表现型为甲醇快速生长型 h“Mllt”的表达菌株，在 500ml 摇瓶中培养，甲醇诱导分泌表达。上清液中重组蝗蛇毒类激血酶 的纯化是通过设计的不同分离纯化方法组合进行的，并对每一种组合进 行了活力与纯度及口收率的评价，结果表明两种组合方式都具有一定的 实用性和可操作性。 通过对类）疑血酶与胰蛋白酶的同源性分析比较，发现二者的催化部 位结构非常相似，井且被相同的小分子化合物benzamidne竞争性抑制， 首次设计将用于亲和分离胰蛋白酶的benzamidine 用到纯化类7疑血酶上 来，实验结果表明分离达到了较好的效果。 与天然蛇毒类凝血酶一致，当用三肽p山itroanilide衍生物作为底物 时，分泌表达的重组大连蛇岛蝗蛇毒类凝血酶具有较强的生色底物活性， 但用精氨酸甲酯如 TAME（N a－厂－tosyl－L－ar。Inine ethyl ester）M BAE＊ N a－benzoyl－L－arglnlne ethyl ester）作为底物时，其酶水解活性较弱。 此重组类凝血酶在37T中性溶液中保存过夜将分解成小肽，但在0T下 很稳定。该酶催化反应的最适pH为8．0，pl为3．5，分子量为28kDa，含 有糖基。根据分子量的差异计算糖基化率为7％，其N一末端氨基酸序列 且l JM If 分析不齐整。重组类凝血酶的热稳定性较差，去糖基后更加不稳定；；
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q785

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本文编号：2666745