人葡醛酸缀合反应转移酶1A9在中国仓鼠肺细胞CHL中的表达及其对药物的代谢研究

发布时间：2020-05-18 18:39

【摘要】： 葡萄糖醛酸转移酶(UDP-Glucuronosyltransferases，UGTs)是一类位于内质网上的膜结合糖蛋白，它是药物Ⅱ相代谢中的一个基因超家族，具有广泛的内、外源性底物。UGTs所催化的葡醛酸缀合反应以UDP-葡醛酸作为糖的给予体，将葡醛酸基连接到含-OH、-COOH、-NH_2、-SH等基团的药物分子上，使成为水溶性代谢物。UGTs能催化各种各样外源和内源的亲脂性糖苷配基底物与葡醛酸的结合，该反应是机体清除外源性(如药物和杀虫剂)和内源性(如胆红素和甾体激素)亲脂性化合物的一个主要方式，也是药物Ⅱ相代谢的重要方式。 UGT1A9是UGT1A亚族中的一员。UGT1族基因基因由四个共同的外显子和一个不同的第一外显子组成，在人类至少已鉴定出12种不同的UGT1族第一外显子[4，5]，，其中，UGT1A族至少有9种蛋白，UGT1A9是其中的一员。UGT1A9未见有多态性基因报道。人类UGTs的表达以组织特异性的方式在肝脏和肝外表达。肝脏是葡醛酸缀合反应的主要场所，几乎含有所有的UGT同工酶。但是UGTs的组织分布并不局限于肝脏，许多肝外组织也表现出一定的葡醛酸转移酶的活性。UGT1A9主要存在于肝中，但也有发现其他组织如结肠、肾脏、前列腺、睾丸、乳腺、卵巢、皮肤以及肿瘤组织中有所表达。 UGT1A9可被多环芳烃诱导及其他化合物如抗氧化剂型诱导剂t-butylhydroquinone。有关UGT1A9的代谢作用研究不多，从文献报道来看，UGT1A9主要催化羟基上的缀合反应，形成O-葡醛酸苷，此外它也能与羧基、羟肟酸形成葡醛酸苷。UGT1A9与黄酮类化合物的代谢作用未见报道。 UGTs的代谢底物多种多样。过去的研究认为，葡醛酸缀合反应有各种底物，而且不同的同工酶催化不同结构类型的化合物，但现在认识到UGTs与底物的关系不是—一对应的关系，底物谱相互有重叠。UOTS作为一套同工酶系统，具有广泛的底物冶，满足体内的内源性和外泪性物质的代谢．关于UGTS的组织分布和调节这方面的知识还不多，过去常采用肝微粒体进行研究，但有以下缺陷： u）肝微粒体是多种药酶沮合的复杂体系，因而实验结果难以区分是＠一种同工醇的作用．（2）UOTs同工酶诣存在明显的种同差异和个体差异．（3）有的亚族在肝中报少甚至没有而是存在于其他器官中。． ‘为解决上述问题，国际上人们己经广泛采用建立各种 UGT转基因细胞系的方式试验，在明确基因构成的倩况下直接获得由特定基因所表达的 UGT同工酶，fi 什对性地研究该酶对药物的代谢作用。在建立葡醛酸缀合酶转基因细胞系方面国内还未有报道，药物的葡醛酸缀合反应研究在国际上也是近十年才达步开展起来的一个药物代谢研究领域．本实验在日内率先建立了UOTIAg的转基因纲囱系，运用DNA重纽拄求，采用叨凋四作为表达我体，在中国仓鼠肺纲胞中使UGTIAg得到了有效地表达，并且以此作为研究葡醛酸代谢的体外试验模型，开展了一些药物的葡醛酸缀合反应研究，预测药物经葡醛酸缀合反应代谢所蕴涵的代谢特征。由于boTIAg主要催化羟基的们醛酿缀合反应，本实验选择具有不同结构类型的含羟基化合物作为底物，一类是羟基处于芳环的异丙酚和扑热息痛，其中异丙酚是gylAg的专属性底物，可以作为活性比较的参照，另一类是羟基处于脂链的普荚讫尔和普罗帕酮．在上述四种化合物研究的基础上，考用类黄酮化合物对叭Xs有各种影响，并且具有各种酚羟基结构，本实验选择了四种类黄酮化合物即们皮素、山费酚、异鼠辛素和芦丁作为底物，观察IX；1’IAg对它们代谢的作用情况，试图了解IjGTIAg在这些化合物的葡醛酸代谢过程中所起的作用。 UGTIAg基因的克医和表达质粒的构建采用RTppR方法从人肝纽织中分别克隆出UG TIA 9的C DNADNA，通过克匡载体昨＊＊1扩槽后，用双酶切组成粘性末端与 u表达载体连接．构建 UGTMg重组子两端的内切酶分别是Hd Ill 和No！．重组子质粒DNA经过亚克医过程将基因从克臼载体转到表达载体上， L 经过删电泳运析袋鲍化，用于转染CHL N山．！‘住塞田包回窒伪凶十田力世的匠甫汇l旦肋勿囱桂山灶业构凶0的舌们厌伪吗 PREpoUGTIAg转染培养的CHL细胞，通过G41g筛这一个月后获得转基冈细胞系，建立了CHtrUGTIAg转基因纲胞系．通过大量培养转基因细胞系，捉取细胞Sg成分，用Lowry法测定蛋肉浓度后，该Sg成分即用于药物代谢研究．
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q55

【参考文献】