BMP-2在降钙素基因相关肽调控MG63细胞增殖分化中的作用

发布时间：2020-05-19 07:00

【摘要】：降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)被证实可以促进成骨细胞的增殖和分化活性，已知的CGRP信号调控通路包括了：胞内钙离子通道(Ca2+)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶(PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胞外信号调节激酶(ERK)等。大量实验证实，骨形态发生蛋白(BMP)也同样拥有诱导成骨的能力。骨髓基质细胞在有BMP-2参与的基础上，通过旁分泌和自分泌作用，在细胞和细胞间质传导信息，刺激DNA的合成和细胞的复制，促进成骨细胞前体的增殖，诱导未分化间充质细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞，提高干细胞的成骨表型和成骨能力，增强碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性，促进细胞间的粘附和成骨细胞标记基因的表达。目前已知的BMP对成骨细胞的信号传导主要包括有Smad，P38MAPK通路。 目前的研究发现：BMP-2，4，6可以促进神经分泌CGRP，CGRP在体外促进牙髓细胞分泌BMP-2，BMP-2体内异位诱导成骨组织中CGRP的神经可以再生分布，BMP-2在腹腔注射CGRP的大鼠胫骨骨折愈合的骨痂中高表达，CGRP在体外协同增加BMP-2诱导成骨细胞增殖的能力。这些研究结果提示：CGRP可以诱导骨组织中BMP-2的表达增加，但两者之间相互作用的信号通路机制目前尚不清楚，因此推测CGRP的促成骨作用可能与BMP-2的表达有相关性。本实验将对CGRP促成骨细胞增殖、分化作用中BMP信号通路所发挥的作用；CGRP促成骨细胞BMP-2表达的影响及其机制等进行研究。 方法 1．细胞培养：人骨肉瘤细胞(MG63)细胞株(中国科学院上海生命科学研究院)接种于培养瓶(100ml)中传代培养(5×106个/cm~2)，培养基为RPMI1640(含10%FBS)，放置于5%CO2孵箱中37°C孵育72h传代，传代至6-7代时使用。 2．CGRP对MG63细胞增殖和分化的调控作用： 2.1MG63细胞增殖：MTT法检测CGRP对MG63细胞增殖的调控作用；流式细胞仪检测CGRP对MG63细胞增殖周期的调控。设定量效作用的浓度为(10~( 10)-10~( 7)M)，时效作用为(24-72h)。 2.2MG63细胞分化：PNPP偶氮法检测CGRP对MG63细胞ALP染色的调控作用；Western blot检测CGRP对MG63细胞碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、骨钙素(OCN)表达的调控作用。设定量效作用的浓度为(10~(-10)-10~(-7)M)，时效作用为(24-72h)。免疫荧光染色检测10-8M CGRP对MG63(48h)ALP表达的作用。 3．CGRP对MG63细胞增殖、分化调控中BMP信号通路的作用： 3.1分组：10-8M CGRP；10-8M CGRP+100ng/ml Noggin；100ng/ml Noggin；空白对照组，作用时间为48h。 3.2MG63细胞增殖影响：流式细胞仪检测MG63细胞增殖周期。 3.3MG63细胞分化影响：免疫荧光染色检测MG63细胞的ALP表达；Western blot检测MG63细胞的ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白表达。 4．CGRP对MG63细胞表达BMP-2的调控作用： 4.1RT-PCR检测CGRP对MG63细胞表达BMP-2mRNA的调控作用：设定量效作用的浓度为(10~(-10)-10~(-7)M)，时效作用为(1-48h)。 4.2CGRP促进MG63细胞表达BMP-2中Noggin的作用： 分组：10-8M CGRP；10-8M CGRP+100ng/ml Noggin；100ng/ml Noggin；空白对照组，作用时间48h。 RT-PCR检测MG63细胞BMP-2mRNA的表达；Western blot检测MG63细胞BMP-2蛋白的表达。 5．CGRP促进MG63细胞表达BMP-2的机制： 5.1分组：10-8M CGRP、10-8M CGRP+5μM H-89、5μM H-89、空白对照组，作用时间48h。 5.2免疫检测试剂盒检测MG63细胞cAMP表达；RT-PCR检测MG63细胞BMP-2mRNA表达；Western blot检测MG63细胞BMP-2、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMPresponse element binding protein， CREB)、磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(Phosphorylated Camp Response Element Binding Protein，pCREB)的表达。 6．统计分析： 所有数据均采用均数±标准差(±s)表示，应用Dunnett，s检验中的t检验和方差分析，进行统计分析，分别设定p0.05以及p0.01表明有显著性差异和差异非常显著。 结果 1．CGRP对MG63细胞增殖、分化的调控作用： 1.1MG63细胞增殖：MTT法检测发现CGRP加入MG63细胞培养基中24-72h的时间段中，CGRP各浓度组的细胞数均显著高于空白对照组(P0.05)，其中以10-8MCGRP浓度组最为明显(P0.05)；流式细胞仪检测细胞增殖周期发现不同浓度的CGRP都加速了细胞周期循环，但是以48h10-8M组最为明显(P0.05)，48h以后有下降趋势。 1.2MG63细胞分化：PNPP偶氮法检测发现各浓度组的CGRP促进MG63细胞的ALP表达量均高于空白对照组，其中以72h10-8M组最为明显(P0.05)，时效对比中发现各浓度组细胞的ALP表达量在72h较48h增加不明显(P＞0.05)；蛋白定量分析结果发现各实验组的ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白表达量均高于空白对照组(P0.05)，其中以48h10-8M组最为明显(P0.05)；免疫荧光染色结果发现48h10-8M组荧光数目较空白对照组多。 2．CGRP对MG63细胞增殖、分化调控中BMP信号通路的作用： 2.1MG63细胞增殖：流式细胞仪检测发现CGRP组和CGRP+Noggin组的S+G2期细胞的数目高于空白对照组(p0.05)，但是CGRP组和CGRP+Noggin组之间没有明显差异。 2.2MG63细胞分化：Wstern-blot检测CGRP组ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白的表达量高于空白对照组(p0.05)；CGRP+Noggin组低于CGRP组(p0.05)。 3．CGRP对MG63细胞表达BMP-2的调控作用： 3.1PCR检测发现8-24小时内只有10-8M、10-7M组可以检测到BMP-2mRNA的表达，且10-7M组明显高于10-8M组(p0.01)；48h10-9M组可检测到BMP-2mRNA表达，但明显低于48h10-8M、48h10-7M两组(p0.01)。 3.210-8M CGRP作用48h，MG63细胞BMP-2mRNA和蛋白的表达量，CGRP组高于空白对照组和Noggin组(P0.01)，CGRP+Noggin组与CGRP组无差异。 4．CGRP促进MG63细胞表达BMP-2的机制： 4.1MG63细胞cAMP含量检测发现，CGRP组和CGRP+H-89组均高于空白对照组(P0.01)，但是前两组之间无显著差异。 4.2CGRP、CGRP+H-89、H-89和空白对照组的CREB表达量无显著差异。 4.3CGRP组的pCREB蛋白表达量高于空白对照组(P0.01)，，但是CGRP+H-89组明显低于CGRP组(P0.01)。 4.4CGRP组的BMP-2mRNA和蛋白表达量高于空白对照组(P0.01)，但是CGRP+H-89组明显低于CGRP组(P0.01)。 结论 1．CGRP促进MG63细胞的增殖与分化，并且具有时间以及剂量依赖性，优势浓度为10-8M，优势时段为48h。 2．CGRP可能通过BMP-2途径促进MG63细胞的分化，而不通过BMP-2途径促进MG63细胞的增殖。 3．CGRP促进MG63细胞表达BMP-2，并且具有时间以及剂量依赖性，优势浓度为10-7M，优势时段为48h。 4．CGRP促进MG63细胞BMP-2表达的可能机制是：通过CGRP促进cAMP合成，从而促进CREB磷酸化，进而促进BMP-2转录。
【图文】：

.1.3.21 MTT 溶液g/L MTT 0.5gS 100ml.2 方法.2.1 MG63 细胞培养及 CGRP 处理骨肉瘤细胞 MG63 细胞株(中国科学院上海生命科学研究院)以 5×于 100ml 培养瓶中培养传代，加入 RPMI 1640 培养基(含 10%FBS)，中 37°C 孵育 72h 传代。传代至 6-7 代时使用(图 1-1)。开始实验前40 培养基培养细胞 24h。实验加入 CGRP 浓度分别 10-10，10-9，10-8CGRP 后 24h，48h，72h 后收获细胞；空白对照组细胞加 1ml RPM)，37℃，5% CO2，培养 24h，48h，72h 作为对照。

2.3 结 果2.3.1 MG63细胞增殖的检测结果(MTT比色法)本实验中CGRP具有明显的促进MG63细胞增殖的作用(图1-2、1-3)。在CGRP作用
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

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本文编号：2670519