自噬系统在朊病毒感染过程中的变化规律及机制研究

发布时间：2020-05-19 19:42

【摘要】：朊病毒病(prion diseases)也称为可传播性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是一类可感染包括人类在内的多种哺乳动物的罕见致死性神经系统退行性疾病。人类朊病毒病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、GSS综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病和致死性家族性失眠症(fatal familial insomnia, FFI)。动物朊病毒病包括羊瘙瘁病(scrapie)、牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。所有类型的朊病毒病具有相似的神经病理学改变：神经元丢失、海绵状空泡形成、星型胶质细胞增生。根据唯蛋白假说(protein-only hypothesis),具有感染性和复制能力的错误折叠蛋白PrpSc是朊病毒病的病原。Borchelt在PrpSc动力学研究中发现,PrPsc的生成是较为缓慢的过程,其半数生成时间(t1/2)为15h。而PrPsc一旦生成,细胞几乎无法降解。因此,我们推测细胞的蛋白降解系统可能在PrPSc的沉积及朊病毒病的发生、发展中发挥重要作用。细胞自噬(autophagy)是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的蛋白降解途径。细胞中的大分子(如：蛋白质、糖类、核酸等)、细胞内源性物质(如：细胞器)和外源性物质(如：细菌、病毒等)均可通过自噬途径降解。自噬由细胞浆中形成的类似脂质体的膜结构起始,不断扩张,包裹被降解底物,融合形成双层膜结构的自噬体,之后自噬体与溶酶体融合,最终底物在溶酶体内被降解。自噬在病毒感染和神经退行性疾病中可能发挥着“双刃剑”的作用。一方面自噬可以降解病毒颗粒和错误折叠蛋白,发挥神经保护的作用；另一方面,过度激活的自噬可以引发自噬相关细胞程序性死亡(autophagy-associated cell death)。为了探讨自噬与PrPSc沉积的关系,揭示其在朊病毒病发生、发展中可能的作用,我们设计了一系列细胞实验和动物实验,以期在体外模型和体内模型两个层面阐明自噬系统在朊病毒病中的变化规律及该变化产生的机制,为深入研发以自噬为基础的抗朊病毒治疗策略提供新的思路。本研究的主要结果如下： 1.以稳定感染羊骚痒因子Chandler株的小鼠脑细胞系SMB-S15为研究对象,经戊聚糖硫酸酯治疗后康复的细胞系SMB-PS为对照,检测自噬小体和自噬流的差异。结果显示,SMB-S15细胞中LC3-Ⅱ表达上调,而p62蛋白含量下降。转染自噬流报告质粒tfLC3的SMB-S15细胞中自噬小体和自噬溶酶体的数量明显增加。表明朊病毒感染细胞中,自噬小体数量增多,自噬流活化。 2.以SMB-S15和SMB-PS细胞分别为研究对象和对照,检测自噬调控相关信号通路的变化。结果显示,朊病毒感染可明显抑制mTOR信号通路,而对Beclinl信号通路影响不明显。此外,在SMB-S15细胞中,mTOR蛋白的E3泛素连接酶FBXW7表达量和其与mTOR的共定位均显著增加。 3.以SMB-S15和SMB-PS细胞分别为研究对象和对照,利用siRNA技术和多种自噬阻断剂抑制自噬流,研究细胞内源性自噬对朊病毒Prpsc沉积的影响。结果表明,阻断自噬可显著增加SMB-S15细胞中Prpsc的含量。 4.以SMB-S15和SMB-PS细胞分别为研究对象和对照,利用shRNA技术,检测敲降FBXW7对自噬系统和朊病毒Prpsc含量的影响。结果表明,敲降FBXW7可以显著抑制自噬并增加SMB-S15细胞中Prpsc的含量。 5.以羊骚痒因子263K感染仓鼠的脑组织标本和人CJD、FFI患者脑组织标本为研究对象,检测朊病毒感染对体内自噬调节信号通路和自噬流的影响。结果显示,朊病毒感染可显著抑制mTOR信号通路并活化自噬系统。 6.以SMB-S15细胞和263K感染仓鼠的脑组织切片为研究对象,通过免疫荧光技术,检测朊病毒PrPSc和自噬小体的共定位情况。在Bafilomycin A1处理SMB-S15细胞后可明显观察到Prpsc和自噬小体的共定位现象,但在263K感染的仓鼠脑组织切片中未观察到此现象。 7.以SMB-S15细胞为研究对象,通过阻断自噬流,研究内源性自噬对细胞活力的影响。以263K感染的仓鼠脑组织切片为研究对象,通过分区分析和尼氏染色研究自噬与神经元丢失的相关性。结果表明,阻断自噬可增加SMB-S15细胞的活力。在仓鼠模型中,自噬小体的增加和神经元丢失在空间上高度相关。综上,我们以SMB细胞和仓鼠、人脑组织标本为研究对象,在体外、体内两个层面证明了朊病毒感染可活化自噬。进一步研究表明FBXW7上调引起的mTOR降解是引起自噬活化的主要原因。内源性自噬的活化促进PrPSc的降解,发挥抗病毒天然免疫的作用。同时活化的内源性自噬可能参与了朊病毒感染引起的神经元死亡。
【图文】：

模式图,模式图,预防控制,病毒病

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所博士学位酸的火活剂，而对蛋白变性剂和裂解剂敏感，故而被认为有自我复制能力的蛋白。David Borchelt在PrpS。动力学研究牛.成是较为缓慢的过程，其半数成时间（ti/2)为15 ho蛋白的存在都是合成与降解达成稳态的结果，因此我们推降解速度较合成速度更为缓慢时，才能形成PrpSe的堆积。蛋白酶K抗性也提示，，Prpse —但在细胞内生成就很难被清除。

过程模式

细胞中的生物大分子（如：蛋白质、糖类、核酸等）、细胞内源性物质（如：细胞器）和外源性物质（如：细菌、病毒等）均可通过自嘴途径降解。自嚼由胞i}中形成的类似脂质体的膜结构起始，不断扩张，包裹被降解物，融合形成双层膜结构的自唾体，随后与溶酶体融合，最终降解其中底物[14]。自丨j基因（autophagy-related gene, ATG)的克隆始于酵母。第一个酵母自嘴基因十1997年被H本科学家Yoshinori Ohsumi研究组克隆，命名为Atgl[15]o第一个哺乳动物自嚼基因于1998年被美国科学家Beth Levine研究组克隆，命名为Beclinl[16]。截止到2010年已经克隆了 34个Atg基因[17]。Atg基因所编码的蛋白贯穿于自嚼的整个过程，按其行使的功能可以分为四大类：自魄膜起始、自_膜延伸、自嘴体运动、自嚼体-溶酶体融合等（如图2所示）。这四类Atg分子在自噻途径的不同阶段发挥作用，进而调节自唾通路。Vesicle breakdown
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373

【相似文献】