RNA去甲基化酶FTO抑制剂的筛选及ALKBH5的晶体结构研究

发布时间：2020-05-21 23:03

【摘要】：m6A是真核生物mRNA和IncRNA中含量最为丰富的一种修饰碱基。m6A影响mRNA的剪接、运输、翻译和降解,参与脂肪生成、精子发生、发育、致癌、干细胞再生以及其他生命进程。 FTO是第一个通过全基因组关联分析发现与肥胖密切相关的基因,也是目前发现与肥胖相关性最强的易感基因。许多研究报道FTO与心血管疾病,Ⅱ型糖尿病,阿尔茨海默氏病和乳腺癌等多种疾病的发生发展密切相关。FTO基因编码一种20G加氧酶,是第一个被发现的mRNAm6A去甲基化酶。本实验室在早期解析FTO蛋白与3-meT复合物晶体结构(PDB:3LFM)的基础上,进一步开展了对FTO抑制剂的设计合成和活性评价。根据FTO晶体结构,结合分子对接分析和高通量虚拟筛选后,设计了120种FTO抑制剂的备选化合物。首先以3-meT为底物,对120种化合物进行体外抑制FTO去甲基化酶活性的系统筛选,最后筛选得到3种结构独特的化合物,它们对FTO去甲基化酶活性有显著影响,将其命名为C1、C2和C3。通过对这3种化合物的结构比较和构效分析,进一步优化出另外两种化合物：C4和C5。然后分别以含：m6A的ssDNA和ssRNA为底物,对这5种化合物的FTO去甲基化酶活性的抑制作用进行了系统检测。结果发现,这5种化合物对FTO的抑制活性均表现有浓度依赖性,FTO酶活性随化合物的浓度升高而降低。其中C1对FTO抑制活性最高,C2次之,C5最低。以ALKBH2和ALKBH5为靶标检测不同抑制剂靶标酶的选择性。结果表明化合物C1和化合物C2也对ALKBH2去甲基活性有明显抑制,化合物C1对ALKBH5有很强抑制作用。实验表明C1、C3、C4这3种化合物在细胞内也有一定程度的去甲基化酶抑制活性。 ALKBH5与FTO均属于AlkB家族成员。ALKBH5是第二个被发现的mRNA m6A去甲基化酶,在睾丸和肺中高表达；ALKBH5可以调控mRNA代谢和运输,并且与精子的生成密切相关。但是目前对ALKBH5如何识别mRNA上的m6A修饰及催化m6A去甲基化的分子机制仍不清楚。本文表达并纯化了ALKBH5不同片段,通过悬滴法筛选得到了可以进行衍射分析的ALKBH5晶体,在上海同步辐射光源收集到分辨率2.4A的衍射数据。数据分析显示ALKBH5晶体属于P212121空间群,一个不对称单位含一个蛋白分子。由于利用分子置换法无法解析ALKBH5的晶体结构,正在尝试利用Se-MAD法解析ALKBH5的晶体结构。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411

【参考文献】