CDR3导向抗体库技术人源化抗膀胱癌单抗BDI

发布时间：2020-05-23 06:47

【摘要】： 本课题在“抗原定向选择法”人源化鼠单抗的基础上探讨了一种新的人源化技术路线——CDR3导向抗体库技术，对抗膀胱癌单抗BDI进行人源化。 首先通过RT-PCR方法从分泌抗膀胱癌单抗的杂交瘤细胞BDI中扩增鼠k链、Fd段基因，DNA序列测定表明分别属于MκⅣ和MH3D亚群。将k链和Fd段基因克隆到噬菌体表达载体p3MH中，在大肠杆菌中获得表达。通过PCR介导的定点突变，将Fd段N端的氨基酸序列矫正为亲本鼠的原始序列，提高Fab的结合活性。运用ELISA、竞争抑制实验、免疫组化实验证实所获Fab为BDI的Fab。 然后根据鼠单抗序列合成含鼠CDR3区的寡核苷酸引物，通过重叠PCR及DNA重组技术，将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和VL组合，构建含BDI CDR3的初级人源噬菌体抗体库，库容为2×10~7；利用loxp-cre定位重组系统，经过在cre~+ BS1365细菌胞内的定位重组后，增加轻重链的组合配对，最终获得容量为1×10~(10)大容量次级噬菌体抗体库。用膀胱癌细胞(EJ)进行四轮的吸附-洗脱-扩增，挑选第四轮筛选后的46个克隆进行ELISA检测，，获得4个能够与EJ细胞特异结合的克隆。竞争抑制实验显示，其中3个与亲本鼠单抗识别相同的抗原表位。测定其可变区基因的序列，VH分别属VHⅠ、VHⅡ亚群，Vk属VkⅠ、VkⅥ亚群。选择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验，显示该克隆能够与癌组织特异性结合。 本研究通过鼠CDR3对人抗体库的限定，使所获抗体库具有预定的偏向性，有利于特定抗体的筛选。同时将loxp-cre重组系统引入噬菌体抗体库中，构建大容量抗体库。不用鼠单抗做模板进行链替换，获得了与鼠单抗识别相同表位的人源抗体。
【图文】：

图2.PCR扩增杂交瘤BDI抗体基因M:DNAmarker(DLZOOO)2.K链基因扩增产物4.Fd段基因扩增产克隆至pGEM一T载体，电转化XL卜Blue菌，选初步鉴定可能有重组的克隆中，各挑(图3)，以Sac工+Xbal鉴定K链，以Xhol+SGEM一K经Sac工+Xba工双酶切后产生300Obp明有K链的重组;以XhO工+Spe工双酶切

图3.重组质粒的酶切鉴定M:DNAmarker(DL1500O)EM载体的酶切(SaCI+Xbal)产物:3，4+Spel)产物.因序列的测定各取2个克隆送北京伯博亚公司测序，2区基因。结果与Kabat免疫球蛋白基因数重链分别属于MKry和MH3D亚群(图4)。TCGTCATGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGVMTQ5PA1M5A5LGTGCACTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCACTTACTTGCACTG
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392.11

【参考文献】

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本文编号：2677296