Nischarin在中枢神经系统的分布及功能研究

发布时间：2020-05-23 16:53

【摘要】：背景：目前针对脊髓损伤的临床治疗仍然缺乏有效手段,如何促进损伤后神经再生,提高临床治疗效果,是神经科学研究者的研究重点。轴突内细胞骨架是脊髓损伤后微环境中多种细胞外部信号在细胞内的整合位点,越来越多的研究均证明通过调控细胞骨架蛋白的重组可综合细胞外部因素和内在因子的作用,显著改善轴突再生的能力并促进功能的恢复。细胞骨架蛋白则受细胞内多种蛋白调控因子调控,因而这些能作用于轴突内细胞骨架蛋白的调控因子对脊髓损伤的修复有着举足轻重的作用。 Nischarin是2000年发现的一种分布于多种细胞胞浆的蛋白质。在过去的十年中关于Nischarin蛋白的功能研究主要集中于它对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用上Alahari及同事发现Nischarin在胞浆内可与Rho GTPase家族的重要成员Rac1、PAK结合并直接抑制它们的活性,从而减弱细胞的活动能力。随着研究的深入,又发现Nischarin不仅能抑制PAK,还能直接抑制PAK下游的关键激酶LIMK的活性,从而阻碍细胞骨架相关蛋白cofilin的磷酸化,进而影响细胞运动能力。这些研究表明,肿瘤细胞的内源性Nischarin可通过调控RhoGTPase/PAK/LIMK/cofilin信号通路,影响细胞骨架蛋白的重组。如前所述,能调控神经元轴突内细胞骨架蛋白重组的因子对脊髓损伤修复有极其重要的意义,Nischarin若在神经元中表达,且也能通过Rho GTPase信号通路调控轴突内细胞骨架蛋白重组,则应该有理由成为脊髓损伤治疗中的一个新靶标。为此,本课题的主要研究目的为：探讨新蛋白Nischarin在正常成年大鼠中枢神经系统的表达与分布；研究Nischarin蛋白在脊髓损伤后轴突再生过程中的作用及其可能机制。获得以上两块内容的实验结果并加以分析,可望拓展对新蛋白Nischarin功能的研究范围,并可能为脊髓损伤的基因或分子治疗提供新的思路和靶点。方法： 1取正常成年大鼠组织,用RT-qPCR、western blot及免疫荧光染色方法检测大鼠各主要器官和中枢神经系统各部位Nischarin的表达情况。 2建立大鼠脊髓损伤模型,探讨损伤后不同阶段Nischarin蛋白在脊髓组织的表达情况；在细胞水平通过RNAi技术抑制内源性Nischarin蛋白表达,采用活细胞成像技术观察神经细胞突起生长的变化。 3采用免疫共沉淀技术研究神经元内源性Nischarin与PAK1、LIMK1的互作情况；探讨Nischarin对PAK1、LIMK1及cofilin的磷酸化调控作用及其对细胞骨架蛋白F-actin的调控；活细胞成像法观察PAK1的特异性抑制剂IPA3对Nischarin-shRNA调控神经突起生长作用的影响。结果： 1Nischarin蛋白在正常成年大鼠的心、肺、肝、肾、胃、小肠、脑和脊髓组织中均有表达,在肝脏和脑组织中最为丰富；其mRNA及蛋白广泛表达于脑的各个部位,在大脑皮层神经元上表达量最高,海马区神经元其次,脑干和嗅球部位则较低,且只表达于神经元而非胶质细胞；在神经细胞内,Nischarin的表达集中在细胞的核周及细胞突起的前缘。 2在正常成年大鼠脊髓组织上,Nischarin主要分布在前角运动核神经元的核周胞浆中；与正常大鼠脊髓组织比较,Nischarin mRNA的表达从SCI后1d起显著增高,损伤后7d达到顶峰(P0.01),随后下降；与之相符,SCI后1d起Nischarin蛋白的表达即有显著增高(P0.05),损伤后7d达到最高(P0.05),此后下降；免疫荧光染色结果提示SCI后3d,脊髓组织结构紊乱,除神经元有Nischarin表达外,胶质细胞上也一定量的表达；损伤后7d,损伤区Nischarin高度表达,大量胶质细胞增生；用aggrecan、CSPGs或TNF-α三种脊髓损伤局部产物处理Neuro-2a细胞,孵育2h后对Nischarin的表达影响不大(P0.05),孵育24h和48h后三者均显著促进Nischarin的表达(P0.05)。 3①用Nis-siRNA转染Neuro-2a细胞能有效抑制内源性Nischarin的表达,抑制率达到86%(P0.01),Neuro-2a细胞的神经突起形态发生明显变化,有突起细胞百分比较control-siRNA组细胞增加3.3倍(P0.001),最长突起平均值增长5.4倍(P0.001),而平均细胞突起数目增加了1.57倍(P0.01)；②将4条Nis-shRNA克隆到慢病毒质粒载体,用脂质体转染Neuro-2a细胞评价其对Nischarin的内源性表达的抑制效果,实时定量PCR结果显示Neuro-2a细胞上的转染效率达到80%以上,与未处理细胞和对照shRNA比较,4个Nis-shRNA质粒均能有效抑制Nischarin的表达,其中Nis-shRNA-3的抑制效率到达60%(P0.05),Western Blotting实验结果与RT-qPCR实验结果相符,4个Nis-shRNA质粒中以3号质粒的抑制效果为最佳,抑制率为81.3%(P0.01)；③用慢病毒包装体系对3号质粒及其scramble对照质粒进行包装,收获病毒液,感染PC-12细胞和原代培养神经元,荧光显微镜下发现抑制内源性Nischarin表达显著促进PC-12细胞神经突起的生长,细胞最长神经突起的平均值增加140%(P0.01),每个细胞的平均突起数目增加56%(P0.05),神经突起生长速度明显增快；抑制内源性Nischarin表达也促进原代培养大脑皮层神经元突起的生长,细胞最长神经突起的平均值增加51%(P0.05),但对神经元的平均突起数目影响不显著(P0.05)；④胶质瘢痕抑制物aggrecan或CSPGs使Neuro-2a细胞的最长神经突起平均值和突起数目均显著下降,而当内源性Nischarin被抑制后,不仅使得PDL基质上的神经细胞的突起生长加速,而且还促使细胞克服CSPGs或aggrecan对神经生长的抑制作用(P0.05)。 4①免疫共沉淀结果显示,神经元内源性Nischarin可以与PAK1、LIMK1结合；②用Nischarin-shRNA转染Neuro-2a细胞使其内源性Nischarin表达量降低75%(P0.01),于此同时,p-PAK1/PAK1比值、p-LIMK1/LIMK1比值及p-cofilin/cofilin比值分别增加了41.5%(P0.05)、40%(P0.05)及57.5%(P0.01)；而在SCI大鼠模型上,Nischarin的表达先增高再下降,在损伤后一周达到峰值,比sham组增高196%(P0.01),而p-PAK1/PAK1、p-LIMK1/LIMK1及p-cofilin/cofilin比值均呈现先降低再增高的趋势,并且均在损伤后一周达到最低值,分别比sham组下降了40.2%(P0.05)、56.3%(P0.01)及61.8%(P0.01)；③免疫荧光染色结果显示,在感染Nischarin-shRNA病毒的EGFP阳性神经元上,神经突起生长锥处F-actin的含量显著增高；④抑制内源性Nischarin的表达可促使抑制性环境下神经细胞的突起生长,但这种促进作用在加入PAK1的抑制剂IPA3之后被完全逆转(P0.05)。结论： 1Nischarin在正常成年大鼠的中枢神经系统呈区域化分布,主要表达于神经元胞浆核周部位及神经突起前缘。 2脊髓损伤可引起Nischarin的表达时间依赖性增高,其表达上调可能与脊髓损伤局部高浓度的TNF-α、抑制性物质CSPGs和aggrecan有关。 3用RNAi技术抑制神经细胞内源性Nischarin的表达后有效促进神经细胞在正常及抑制性环境中神经突起的生长。 4神经元内源性Nischarin与PAKl及LIMK1存在互作关系,直接抑制PAK1的磷酸化,并影响LIMK1和cofilin的磷酸化过程；这一机制可能介导了Nischarin蛋白对神经突起生长的抑制作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R338.2

【参考文献】