MHC-肽四聚体的构建及临床初步应用

发布时间：2020-05-24 03:36

【摘要】：抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cyotoxic T lymphocytes, CTL)通过识别细胞表面与主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅰ类分子结合的抗原肽而杀伤靶细胞，是机体抗肿瘤、抗移植物及有效控制各种感染的重要免疫防御反应之一。定量分析CTL可为阐明免疫应答的自然发生过程提供重要信息。传统的定量CTL的方法如~(51)Cr释放实验、有限稀释法(limited dilution assays, LDA)等需要体外淋巴细胞培养，费时费力，敏感性低。新近开发的由人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)重链和β-2微球蛋白(β-2microglobulin, β-2m)轻链、抗原肽和染料标记的连接蛋白组成的四聚体试剂，具有高敏感性、特异性和高效性等特点，不仅能够直接计数抗原特异性T细胞，还能对其进行表型和功能方面的分析，大大推进了我们认识抗原特异性CTLs在疾病中作用的研究。在四聚体的合成中，首先用基因工程法合成MHC重链和β-2微球蛋白轻链。但迄今为止，国外合成的这两种蛋白均采用化学诱导剂IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)来诱导。IPTG诱导蛋白表达不仅价格昂贵、操作繁琐，而且对细胞有较强的毒性，不适合大规模发酵培养。本研究利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中扩增出HLA-A0201细胞膜外部分和去除信号肽部分的β-2m基因；以RT-PCR产物为模板，利用PCR方法将含有可供识别生物素化位点的15个氨基酸残基序列(substrate peptide for BirA-dependent biotinylation, BSP)和甘氨酸-丝氨酸接头的序列接在HLA-A0201胞外区的COOH端。分别将HLA-A0201-BSP和β-2m基因克隆入pBV220表达载体进行表达。表达产物经SDS-PAGE电泳分析：分别在大约33kD和12kD处有一新生带，与预期结果相符；经凝胶成像仪分析软件分析，pBV220-HLA-A0201-BSP和pBV220-β-2m的表达量分别占菌体总蛋白的46％和26％；经可溶性分析显示，pBV220-HLA-A0201-BSP和pBV220-β-2m主要以包涵体的形式存在，分别为90％和85％。表达水平与诱导的时间和温度相关。实验表明：最适的细菌生长温度为37℃，在该温度下，大部分表达蛋白以包涵体形式存在；最适诱导温度42℃，且诱导4小时与过夜诱导表达量没有显著性差异。同时为获得目的蛋白的高效表彦必丈学居学虎薄士探兑全笋世居戈. 叭戈有萝达，在不同表达载体和不同宿主菌中进行了比较，在pET一30a(+)，pET一28b (+)，pET一22b(+)，pET42b(+)和pKKH中，pET一28b(+)表达量最高，其次为pET一22b(+);而不同宿主菌间表达量并无明显差异。提取表达的HLA.A0201一BSP和你Zm蛋白的包涵体，洗涤、溶解后进行纯化。根据等电点分析，首先采用5 Sepharose FF柱，收集穿过峰。再过Q Sepharose FF柱，利用NaCI梯度洗脱法收集50 mM NaCI所在峰。HLA一A0加卜 BsP再经sephadex一G50柱进行脱盐。HLA一Ao加1一BsP是非可溶性蛋白，只有在B一Zm存在下可复性。经分析其纯度为95%左右，浓度为1.5叭J;而0一Zm是可溶性蛋白质，脱盐后继续脱尿素。用sePhadex G-25柱进一步脱盐脱尿素，尿素浓度由6mo巩降至2 mo比，再以水透析。经分析其纯度为95%以上，浓度为1.2叭;采用westem blot法来鉴定HLA一A0201一BsP和B.Zm的免疫学性质。杂交结果显示诱导菌泳道中对应HLA-AOZOI一BSP和仙.2m分子量处各有一条较强的杂交带，而只加未诱导菌体的泳道没有杂交带。将纯化好的HLA一A0201一BSP融合蛋白、B一Zm以及特异性肤(HBV/H CV) 折叠复合，形成HL左A0201一肤复合物，再以BirA酶作用于融合在HLA一A0201 蛋白C端BSp(substrate伴ptide for Bi叭一dePendent biotinylation)中的赖氨酸残基上，使其生物素化。生物素化的复合体再分别经sephacryl一300和MonoQ柱进行纯化。该复合物与藻红蛋白标记的亲和素以4:1比例混合而构建成四聚体。用此四聚体标记已分离好的PBMC，在流式细胞分析仪上进行分析。在急、慢性乙肝患者中，抗原特异性细胞毒CDS+T细胞的频数分别为1 .84%和 0.02%司.68%，而在慢性丙型肝炎患者中为0.02刃.72%:同时，采用EUSPOT 方法检测了抗原特异的IFN一丫分泌cDS+T细胞(个细胞/孔，2 x 106/ml/ 孔)。慢性乙肝患者组:特异性肤刺激组99.5肚42.08;非相关肤对照组 21 .0妊14.43;自身对照组20.78月2.32;特异性肤刺激组与非相关肚对照组和自身对照组之间存在显著差异(P0.01).慢性丙肝患者组:特异性肤刺激组 43.01土22.08;非相关肤对照组6双汪4.43:自身对照组6，肚3.43;特异性肤刺激组与非相关肤对照组和自身对照组之间存在显著差异(P0.01)。健康对照组:自身对照组、特异性肤刺激组与非相关肤对照组均在肚4.03之间，且各组之间没有显著性差异。· 磨边才笋曹笋雳薄士好芜生.笋世老戈‘ 本研究获得HLA一A0201一BSP和价Zm蛋白的高效表达，为研究在原核系统中表达、纯化，以及进一步利用亲和素在体外构建MHC一I类分子四聚体，，研究抗原特异性细胞毒T淋巴细胞功能等奠定基础。构建的此四聚体不仅为构建其他抗原特异性四聚体奠定基础，而且也为临床治疗乙、丙型肝炎提供实验室依据，并为临床用
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【引证文献】