抗人TNF-α单抗Z12识别的抗原表位研究及其人源化改造

发布时间：2020-05-24 01:05

【摘要】： 本论文的创新点在于建立一种以计算机模拟结果为理论依据从而指导实验设计和操作的技术方法，使其作为一种有力的工具用于分析蛋白的结构-功能关系(如抗体识别的抗原表位)、合理的药物设计(如抗体的人源化改造)等研究。以已有晶体结构的人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)，作为研究靶抗原。hTNF-α在许多疾病的生理和病理反应中都发挥关键作用，因而成为治疗这些疾病的有效靶分子。抗hTNF-α中和性单抗作为hTNF-α活性的阻断剂，已被用于治疗类风湿性关节炎、脓毒性休克和炎性肠病等疾病，在国际和国内都有广阔的发展前景。本室研制的小鼠抗hTNF-α单抗Z12，由于具有中和活性和较高亲和力，因而具有理论研究和实际应用意义。抗原表位的确定和抗体的人源化改造是抗体研究工作的两个主要方面，利用计算机模型可为上述工作提供极大的帮助。首先钓取了Z12抗体的可变区基因，利用同源模建、分子对接等方法，模拟了Z12 Fv的三维结构和抗原抗体复合物模型，由后者预测抗体识别的抗原表位；随后通过寻找抗原表位的实验研究，，确定了Z12抗体结合hTNF-α的主要部位(hTNF-α141-146)，并证实了计算机模型是可靠的；在认为是可靠的计算机模型的基础上，对Z12抗体的可变区进行了合理的人源化设计(将VH骨架区中88位Ser突变为Ala，VL骨架区中17位Glu和18位Lys分别突变为Asp和Arg)；最后完成人源化抗体基因的克隆、表达，活性研究的结果表明人源化抗体很好地保持了亲本抗体的特异性和亲和活性。通过以上研究，一方面确定了Z12抗体识别的抗原表位，另一方面获得了有意义的人源化抗体，并申请了一项国内发明专利。本研究中的Z12抗体可变区基因序列由本室获得，具有独立的知识产权；抗体的可变区序列、抗体识别的抗原表位以及人源化改造方法与已公开发表的抗体均有所不同。
【图文】：

模式图,抗体,区域分布,抗原

抗体作用模式，通过亲疏水性对hINF一a参与同抗体作用给出了抗原hTNF一a参与同212抗体作用的区域分布模TNF一a的141一146位为212抗体特异性识别的主要区域。图L13参与同212抗体作用的hTNr一a区域(被212抗体识别的hTNF-a区域)模式图Fig.l.13ThesketehmaPofhTNF一任areaswhiehinteraetwith212antibodyorarereeogn让edby212antibody

酶切鉴定,重组质粒,质粒

pU诩F一a质粒将被切成一条线形条带。此外，由于Hindm的酶切位点(位于终止码之后15个碱基位置处)依然存在，因此被其消化后，pUTNF92一157同pUINF一a质粒一样呈现一条线形条带(见图2.4A)。(A)M8(B)M910(C)叫~-377图2.4重组质粒的酶切鉴定Fig·2·4IdentifieationofreeombinantPlasmidbyrestrietionenZyme(A)pUTNF92一157的酶切鉴定(B)pu翎Fo53一91重组质粒的酶切鉴定l:recombinantPlasmidofPUTNF92一157;8:PUTNFD53一9一/Ncol+从月dHI2:PUINF92一157/EcoNI;3:PUI，NF一a/ECoNI;(C)pUTNFD29一88重组质粒的酶切鉴定4:pUTNF92一157/从”ell;9:PUTNFD29一88/Ncol+去几月dlll:5:PUTNF一a/去刀刀e11:10:PU诩F一a/入七口I+劲刀dlll6:PUINF92一157/去厅”dlll:7:PUTNF一a/Hindlll:在pUINF一a质粒中，编码基因的起始码之前和终止码之后分别有Nc口I和Hindln酶切位点，用它们同时消化该质粒可得到494bP的小片段。pU诩FD53一91和pUINFo29一88重组子分别缺失39aa(117bp)和6oaa(18obp)，因此用肠01和Hindln双酶切两质粒后，将分别得到377bP(见图2.4B)和314bP(见图2.4c)的小片段。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【参考文献】