蛋白质相互作用结构域PDZ结合特性的研究方法

发布时间：2020-05-28 11:33

【摘要】：本部分介绍了一种新的随机多肽文库的构建方法，，即用基因组DNA为原料来构建随机多肽文库。一般认为，基因组DNA是不能够直接用来表达出有生物学意义的蛋白质或多肽。但是，如果我们需要的是随机多肽，基因组DNA就可以被认为是非常有用的资源。当大的基因组DNA被仅识别4个核苷酸的限制性内切酶酶切后，产生的短片段DNA可以近似的认为是随机序列的片段，这样的短的随机片段在本实验中被用来直接表达随机多肽，成为随机多肽文库。例如人的基因组DNA为2.91×10~9bp，这样大的基因组DNA经识别4个核苷酸的限制性内切酶(DpnⅡ或Tsp509I)酶切后，因为这种酶在基因组上平均每隔256bp即有一个酶切位点，因此可以产生约10~7(2.91×10~9／256)个片段。由于每个片段的平均长度为256bp，所以这样的片段可以编码85个氨基酸(256／3)，又由于每64个密码子当中有3个终止密码子，所以最后这样的片段表达出的多肽的平均长度为21个氨基酸(64／3)。这些片段可以克隆到任何表达载体中。在这里我们将这些片段连接到用DpnⅡ(Tsp509I)的同尾酶BamHI(EcoRI)预先酶切的酵母双杂交载体pGADT7上后，电击转化大肠杆菌形成随机多肽文库。在论文中，我们构建了两个这样的随机多肽文库。一个是用DpnⅡ酶切人基因组DNA，所构建的文库的容量为1.1×10~6cfu。另一个是用Tsp509I酶切人基因组DNA，所构建的文库的容量为1.4×10~7cfu。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R341

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