重组丙型肝炎病毒结构蛋白抗原表位的表达及免疫原性

发布时间：2020-05-28 10:56

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)是导致输血后肝炎和非甲非乙型肝炎的主要病原，全世界有1.7亿HCV感染者，约50％～90％的感染者转变为慢性持续性感染。HCV抗原表位的研究，将有助于解决对这一高度变异的病毒的致病机制的认识及预防、治疗方面遇到的难题。本文对HCV一些保守的B淋巴细胞识别的抗原表位的基因合成、克隆、表达及免疫学性质进行了研究。 HCV C蛋白的结构保守，其N端具有明显的亲水性，含有多个保守的抗原表位。我们选择其中2个保守的抗原表位C1、C2(C_(2～21)，C_(33～46))进行化学合成，合成的基因片段以Bsu 36I位点构建到昆虫病毒Flock house virus(FHV)的结构蛋白编码基因RNA2的L1(aa205)位点上。我们之所以选用FHV-RNA2编码的昆虫病毒外壳蛋白作为嵌合表达抗原表位的载体蛋白，是因为其表面有多个亲水区域，可供小片段外源抗原表位插入。这些可供插入的位置分别是FHV-RNA2上的3个环(Loop，简称L)和3个插入位点(Insert，简称I)，它们都突出于FHV-RNA2编码的外壳蛋白分子表面，这种特殊的结构增加了外源抗原表位获得接近其天然构象的机会，并将外源抗原呈递于外壳蛋白的表面，使其具有很高的亲水性，有利于提高表达产物的抗原性及免疫原性。重组质粒pET-RNA-C1、pET-RNA-C2在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了稳定高效表达，表达产物占菌体总蛋白的35％左右。Western Blot结果表明，该蛋白可被抗-HCV阳性病人血清特异识别。利用Q-FF／HP阴离子交换层析和SDS-PAGE凝胶电泳纯化分离重组蛋白。纯化的重组抗原免疫豚鼠后诱导产生了高滴度的抗HCV C蛋白表位的抗体；Western Blot和ELISA检测结果显示：重组抗原RNA-C1、RNA-C2具有良好的抗原性及免疫原性；并且证明了FHV RNA2抗原表位呈递系统可使外源HCV C1、HCV C2表位的抗原性及免疫性有不同程度的改善(p＜0.05)。
【图文】：

重组质粒,抗原表位

阳性克隆用SpeFNeol双酶切后，应分别产生4sgbp和468bp大小的片段，1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，重组质粒pET~RNA一Cl、pET-RNA一CZ构建正确。见图1.3。EPT一RNA一cl、EPT一RNA一2c测序结果表明，重组质粒中所插入的Cl、CZ抗原表位基因与预先设计完全相符。见图1.4、1.5。2.重组pET-RNA一cl抗原表位基因在大肠杆菌中的表达pET一RNA一cl、pET一RNA一cZ抗原表位基因在大肠杆菌BLZI中的表达产物分子量分别与预期值(46.2Dk‘和45.5KD)相符，，表达蛋白量占菌体总蛋白的35%左右。见图1.6。bp123今558T、540‘、、504~es‘上二二458尸曰勺曰户.户~~.es267、~~味一-一234eees竺二竺213曰代Zee一192/产图1.3重组质粒，__、:‘牛梦‘，-3称srticti叩naa，ys‘5ofrecombnian‘p，as而dspE示。A一eland面一ha一eZ石并渴成骂瀑默霉笃欲{矛i磊群A一C“‘ge’‘e‘“‘htSpe““c。“‘89bp，;

序列测定,重组质粒,抗原表位,基因

RNA一CZ构建正确。见图1.3。EPT一RNA一cl、EPT一RNA一2c测序结果表明，重组质粒中所插入的Cl、CZ抗原表位基因与预先设计完全相符。见图1.4、1.5。2.重组pET-RNA一cl抗原表位基因在大肠杆菌中的表达pET一RNA一cl、pET一RNA一cZ抗原表位基因在大肠杆菌BLZI中的表达产物分子量分别与预期值(46.2Dk‘和45.5KD)相符，表达蛋白量占菌体总蛋白的35%左右。见图1.6。bp123今558T、540‘、、504~es‘上二二458尸曰勺曰户.户~~.es267、~~味一-一234eees竺二竺213曰代Zee一192/产图1.3重组质粒，__、:‘牛梦‘，-3称srticti叩naa，ys‘5ofrecombnian‘p，as而dspE示。A一eland面一ha一eZ石并渴成骂瀑默霉笃欲{矛i磊群A一C“‘ge’‘e‘“‘htSpe““c。“‘89bp，;，二3.重组pET~RNA一C抗原的纯化制备3.1超声裂解细菌细胞第19页
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392

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