紧密黏附素转移受体Tir在EHEC粘附损伤中的作用研究

发布时间：2020-05-31 01:36

【摘要】： 肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 :H7是一类食源性病原体,能引起一些列人类疾病,如腹泻、出血性肠炎(HC)和溶血性尿毒综合征(HUS)等,严重症状的可导致死亡。EHEC的感染能够导致A/E损伤和分泌志贺毒素,目前国内外的研究也主要集中在这两部分。A/E损伤能够在病原菌粘附宿主细胞位置形成肌动蛋白聚集的“基座”样结构,并引起与宿主细胞复杂的相互作用。我们通过对EHEC紧密粘附素转移受体(Tir)的体外表达和Tir缺失突变株的构建,研究EHEC与宿主细胞的相互作用,并通过转录水平的检测,初步探讨其损伤致病机理。第一部分EHEC黏附损伤相关毒力因子Tir、TccP的重组表达与鉴定 EHEC O157:H7紧密粘附素intimin为病原菌定殖及引起A/E损伤的关键因子,而Tir是病原菌自身编码的intimin受体蛋白。本实验在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7紧密黏附素受体(Tir)全分子蛋白的高效表达,并对其生物活性初步分析鉴定。应用分子生物学技术钓取tir基因,构建了pET-22b(+)-tir表达质粒,经测序鉴定后转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,目的蛋白以裂解上清形式表达,表达量约10mg/L。经镍柱纯化后纯度达90%以上。将FITC标记到重组表达的Tir蛋白上,与HEp-2细胞相互作用,在荧光显微镜下观察Tir能够嵌入细胞膜,说明我们重组制备的蛋白具有生物学活性,为进一步研究Tir与Int281相互作用及其在粘附中作用奠定基础。 TccP是紧密粘附素受体与细胞骨架联接蛋白。在EHEC中参与A/E损伤的形成,起到类似Nck蛋白的作用。应用原核表达系统构建并表达了TccP蛋白。所得到包涵体形式的TccP蛋白,采用盐酸胍变性、梯度尿素复性的方法得到可溶形式的TccP蛋白,纯度达到85%以上。第二部分Tir、TccP、Int281分子间相互作用及Tir在细胞粘附中的作用研究Intimin是EHEC外膜蛋白,它在病原菌的粘附过程中起重要作用。Intimn的受体包括病原菌LEE毒力岛编码的Tir以及宿主自身受体蛋白nucleolin和β1-integrin。已有研究认为,intimin与Tir相互作用所产生的信号诱导了A/E损伤的形成。失去了与intimin结合区域的Tir蛋白依然能够嵌入细胞膜,并能够使酪氨酸磷酸化,但不能诱导肌动蛋白的聚集。在这部分工作中,针对EHEC与宿主细胞相互作用中存在多种受体,我们尝试分别在分子和细胞水平阐明受体Tir在EHEC黏附中的作用。首先利用本室前期重组表达的Int281,通过分子相互作用分析,比较Tir、integrin受体的结合能力。我们用重组Tir蛋白免疫兔子,制备效价106免疫血清。然后利用ELISA方法验证Int281与Tir具有结合活性,且结合能力大小与蛋白浓度相关。进一步,利用SPR技术,采用氨基耦联方式将蛋白Tir耦联于CM5芯片表面。利用BIAevalution分析软件处理数据,显示Int281与Tir结合量,计算出EHEC来源的Int281与Tir亲和力常数为KD: 1.28E-8 (12.8nM),表明Tir是Intimin的特异高亲和力受体。利用ELISA原理测定integrin与Int281、TccP与Tir相互作用,发现过量的integrin与Int281具有结合活性,而TccP与Tir不具有结合活性;SPR技术测定结果同样证实:integrin与Int281的结合活性很弱、而TccP与Tir不发生直接相互作用,表明宿主细胞自身的膜蛋白integrin是Intimin的弱亲和力受体。为了进一步了解受体Tir在EHEC细胞粘附中的作用,我们利用Red重组系统构建了tir基因缺失突变株,发现构建含有tir基因上、下游各500bp同源臂具有更高的重组效率。在得到tir基因缺失突变株Δtir:EHEC的基础上,以HEp2细胞为模型,将不同数量级的野生型EHEC与Δtir:EHEC分别与细胞作用,利用平板计数方法测定粘附到细胞上菌落数量。发现Δtir:EHEC在粘附数量上均明显少于野生型EHEC(P0.01)。并且当补加重组Tir蛋白(Tir终浓度小于30ng/μl)后,Δtir:EHEC粘附数量明显上升(P0.01)。这表明EHEC自身受体Tir做为高亲和力受体与宿主提供受体如integrin等相比,在EHEC粘附中起着更重要的作用。第三部分Tir对A/E损伤细胞模型相关基因表达丰度的影响 EHEC能够诱导宿主细胞发生A/E损伤,它引起宿主细胞肌动蛋白大规模的重排,涉及一系列细胞骨架及其它相关蛋白。A/E损伤最显著的特点是在上皮细胞表面细菌粘附位置处形成一个上升的“基座”样结构。Tir是已知的形成A/E损伤关键TTSS效应器蛋白,在EHEC中,近来又发现第二个关键效应蛋白,即TccP。EHEC需要TccP来弥补因缺乏相应Y474,而导致的不能激活Nck途径。TccP正是起着类似Nck蛋白的作用。Tir通过其N末端和C末端区域和许多宿主蛋白相互作用,如α-actinin、talin、vinculin等。这些蛋白通常以直接方式作用于质膜磷酸酯层,或以间接方式作用于和质膜相联系的蛋白,以此联系着细胞膜和骨架蛋白。在这部分工作中,我们试图通过在体外细胞水平上,对发生由EHEC感染所引起A/E损伤的HeLa细胞进行mRNA水平检测,并且以我们构建的tir缺失突变株Δtir:EHEC同样感染HeLa细胞,来探索Tir与宿主细胞蛋白如肌动蛋白、α-actinin等在转录水平上的关系。我们首先建立EHEC O157感染HeLa细胞诱发A/E损伤的模型。用野生型EHEC和Δtir:EHEC分别感染HeLa细胞,对感染条件进行摸索,发现在106CFU感染剂量以及4小时感染时间内,A/E损伤特征性“基座”现象最明显,利用激光共聚焦显微镜可观察野生型EHEC菌株O157 :H7 EDL933对效应细胞造成典型的A/E损伤,肌动蛋白聚集重排;而Δtir:EHEC明显丧失了致HeLa细胞A/E损伤的能力。在此细胞模型基础上,我们进一步通过提取感染后HeLa细胞总RNA,反转录成cDNA,并以cDNA为模板,利用实时荧光定量PCR技术,检测α-actin、α-actinin两个基因mRNA水平上的表达丰度变化。结果显示α-actin、α-actinin两个基因mRNA水平在两组感染中均下调(p0.01)。且α-actin基因mRNA水平在Δtir:EHEC感染组下降趋势大于野生型EHEC感染组(p0.01)。野生型EHEC感染组α-actinin基因mRNA水平在感染后1小时急剧下降,mRNA相对值小于Δtir:EHEC感染组(p0.01);而1小时之后,EHEC感染组α-actinin基因mRNA水平略有回升,在2小时之后持续下降,且mRNA相对值大于Δtir:EHEC感染组(p0.01)。结果显示在EHEC感染HeLa细胞过程中,Tir对α-actin和α-actinin基因mRNA表达水平有影响,相关机制有待进一步研究。本研究通过对Tir重组表达及tir基因缺失突变株构建,进一步了解了Tir蛋白在体外分子、细胞水平与intimin相互作用以及Tir在EHEC粘附过程中的关键作用,明确了其作为高亲和力受体的特性,并且初步发现Tir对α-actin和α-actinin基因mRNA表达水平的影响。
【图文】：

基因,细胞,平铺,孔板

胞平铺于 6 孔板，细胞密度为 10各 100μl与Hep2 细胞 37℃下共同察被标记的细胞。 1686bp 的 tir 基因裂解菌为模板，调取 tir 基因。大小为 1686bp 的 tir 与条带所在回收 PCR 产物，并连入 pEASY tir 基因与 Genbank（GeneID: 960

质粒,标签,裂解液,蛋白表达

2. 用 NdeⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定 pET-22b(+)-tir 质为 DL2000 DNA marker，2 泳道为 pET-22b(+)-tir道为双酶切后的 pET-22b(+)-tir 质粒。3 泳道中被酶r 大小与预期吻合。达、纯化和鉴定ET-22b(+)-tir/BL21 全菌裂解液进行 SDS-PA0kD 处明显有一条蛋白表达带，见图 3，3解液在相应位置却没有明显表达，见图 3，超声上清中蛋白含量明显多于沉淀，见图标签的抗体进行 Western blotting，用 DAB 显0kD 处有一条特异条带，与预期位置吻合，亲和柱纯化带 6×His 标签的 Tir，经薄层扫
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

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