与自身免疫性溶血性贫血相关基因的克隆及在原核生物中的表达

发布时间：2020-05-31 10:59

【摘要】： 本文应用噬斑原位免疫杂交技术，以AIHA病人血清为探针，从人脾cDNA文库中筛选与自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia, AIHA)相关的基因。发现CD59基因和U1 70kd基因与AIHA有对应关系，并对若干病人的CD59基因的第3和第4外显子进行了测序分析。但是未发现任何基因突变，推测病人体内产生CD59抗体，从而影响了CD59对细胞的保护功能。 本文克隆了除信号肽部分以外的CD59 cDNA，并利用大肠杆菌表达载体pET28b(+)表达重组人CD59(rhCD59)。我们分离和纯化了rhCD59，还对其生物活性作了初步研究，结果表明rhCD59具有较好的免疫原性，并能保护细胞免受补体介导的溶破作用。这为进一步探讨rhCD59在临床上的应用奠定了较好的基础。 由于棒状杆菌生长速度快，无内毒素、无胞外蛋白酶，也不会形成包涵体，产品易分离和纯化，因此在棒状杆菌中表达医用rhCD59很有意义。本文在构建棒状杆菌表达载体的过程中分离到一个新的棒状杆菌质粒pXZ608。该质粒全长5949 bp，GC含量为57％，有6个大于300 bp的开放读码框(open reading frame，ORF)。其中，ORF1表达的多肽序列与pIJ101/pJV1滚环复制家族的复制蛋白Rep有一定的同源性，并具有滚环复制所需的保守区域，推测该质粒也属于滚环复制家族。通过缺失分析，，2.14 kb BstEII-SacI片段被确定为pXZ608的复制区，该复制区仅包含ORF1。本文也利用质粒pXZ608和大肠杆菌质粒构建了棒状杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，并在棒状杆菌中成功地表达了rhCD59，但是表达量有待进一步的提高。
【图文】：

pXZ608全序列

3. 基因的测序分别以重组子质粒多克隆位点侧翼的T7和SP6启动子为起点, 进行双向测序 序列测定用DNA自动测序仪在上海申友生物工程公司完成 序列如图4-3, 图4-4 克隆到pLC21上的DNA共339碱基对 3’末端有58 bp的多聚A 克隆到pLC25上的DNA有960碱基对 无多聚ApLC21:------ caacgc gttggg agctct cccata tggtcg acctgc aggcgg ccgcac tagtgaSacI NdeI SalI PstIttGGTG GCGACG ACTCCT GGAGCC CGAGAA TGGGTA TTTGAT GGAGGC TGCGCC GGAGTGAAGAGG TCGTCC TCTCCA TCTGCT GTGTTT GGACGC GTTCCT GCCCAG CCCCTT GCTGTCAT
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q785

【参考文献】

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本文编号：2689752