人脐带间质干细胞通过巨噬细胞参与修复肾缺血再灌注损伤研究

发布时间：2020-06-03 06:28

【摘要】：目的：间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植对缺血-再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)等造成的肾组织损伤具有保护和促修复作用,是一种有效的细胞替代疗法,然而其确切的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨MSCs对巨噬细胞的免疫调节作用,以及巨噬细胞在MSCs发挥肾保护性作用机制中的影响,从而揭示一种新的间质干细胞移植治疗肾损伤的机制,为MSCs的临床应用提供必要的理论基础与依据。方法：采用人脐带来源的间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),经尾静脉移植治疗C57BL/6小鼠肾缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)模型,并分别于术前、再灌注后1～10天内不同时间点动态收集小鼠血液、组织标本,观察hucMSCs的肾保护作用并探讨机制。采用红色荧光染料CM-Dil标记技术,对hucMSCs进行体内示踪定位。检测小鼠血清中肌酐(creatinine, Cr)与尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平,评价hucMSCs治疗前后I/R损伤小鼠的肾功能改善情况。肾组织切片H＆E染色及小管损伤评分揭示hucMSCs对肾组织结构完整性的保护作用。通过PCNA免疫染色以及TUNEL分析hucMSCs移植对肾组织细胞增殖、凋亡的影响。免疫组织化学法对各组动物肾脏中F4/80+巨噬细胞进行染色,评价hucMSCs处理前后I/R损伤肾组织中巨噬细胞浸润数量的改变。同时,经免疫组织化学检测肾脏中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protine-1, MCP-1)的表达,从损伤微环境中趋化因子的角度初步探讨hucMSCs影响巨噬细胞浸润的可能机制。流式分析肾组织中CD206+细胞占CDllb+巨噬细胞的百分比,评价hucMSCs对体内巨噬细胞向M2表型转换的作用。通过尾静脉注射脂质体包裹的氯膦酸盐(liposome-dichloromethylene bisphosphonate, lipo-Cl2MBP)清除动物模型内的单核-巨噬细胞,再经肾组织病理切片观察其对hcMSCs发挥损伤修复作用的影响。采用定量RT-PCR分析hucMSCs治疗前后以及巨噬细胞清除后小鼠肾组织中炎症因子IL-1p、IL-6和IL-10的mRNA水平,研究损伤局部炎症状态的改变。在体外,将RAW264.7小鼠巨噬细胞株与hucMSCs共培养,分别检测了巨噬细胞的免疫表型及炎症因子的表达。流式细胞仪分析共培养后RAW264.7细胞表面M2型巨噬细胞标记物CD206的表达情况；RT-PCR及ELISA分析RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、arginase-1和IL-10的mRNA和蛋白表达水平。结果：hucMSCs经尾静脉注射后,可迁移、定位至小鼠肺脏与损伤肾脏的局部。hucMSCs治疗组小鼠各时间点血清Cr、BUN水平明显下降,肾组织损伤程度减轻,且肾小管细胞的增殖加速、凋亡减少。hucMSCs治疗组小鼠与PBS对照组相比,其肾组织中巨噬细胞的浸润明显减少,以再灌注后5天改变最为显著。同时,免疫组织化学分析表明I/R损伤的肾小管上皮细胞高表达对巨噬细胞有趋化作用的因子MCP-1,而hucMSCs处理可降低该因子在肾组织中的表达。对IRI晚期(再灌注后5天)肾组织中巨噬细胞的免疫学分型进行流式细胞检测后发现,hucMSCs治疗组与PBS对照组相比,其肾组织中具有促修复作用的M2型巨噬细胞比例明显增加。清除I/R损伤早期小鼠体内巨噬细胞,对hucMSCs的组织修复具有明显的促进作用；相反,对IRI晚期体内巨噬细胞的清除则可抑制hucMSCs的肾保护性作用。定量RT-PCR结果显示,hucMSCs治疗组的促炎因子合成减少而抑炎因子表达增高,具有缓解损伤局部炎症的作用。体外与hucMSCs非接触共培养(Transwell)或直接接触培养的巨噬细胞株RAW264.7,其CD206表达水平明显高于RAW264.7细胞单独培养组,且炎症因子IL-1p、IL-6表达降低,arginase-1与IL-10表达升高。结论：hucMSCs移植对C57BL/6小鼠的肾缺血-再灌注损伤具有保护及促修复作用。该治疗作用的发挥与其减少肾组织内巨噬细胞浸润,加速损伤局部炎症消退以及促进巨噬细胞表型转换有关。hucMSCs通过对损伤局部以及体外共培养实验中巨噬细胞免疫表型以及炎症因子表达谱的调节,促进其向具有修复功能的M2型巨噬细胞转变,从而发挥修复肾组织损伤的作用。与干细胞的转分化和旁分泌治疗机制相比,本研究提出干细胞修复急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的过程中有不同亚型巨噬细胞的参与,这为MSCs体内发挥促损伤修复作用提供了一种新的机制。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329

【参考文献】