低氧激活Notch通路抑制间充质干细胞成骨分化的机制研究

发布时间：2020-06-03 10:25

【摘要】：目的：骨缺损修复一直是医学研究的重点之一。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)以其生物学特性吸引了诸多学者的目光。氧作为生命活动所必需的环境因素,对间充质干细胞的增殖、分化具有重要的调节作用,同样,氧的存在也是MSCs的存活、增殖和分化过程中不可缺少的条件之一。骨髓中的氧大约是1%-7%pO2,这比一般环境中的20%低很多。在病理条件下如骨缺损的修复过程中,MSCs需保持在更低的氧的环境中发挥它应有的作用。本实验的目的是研究低氧对MSCs成骨分化的影响;在MSCs的成骨分化过程中低氧与Notch信号之间的关系以及低氧条件下Notch(?)言号对MSCs成骨分化影响的机制。 方法：在1%pO2(低氧)或21%pO2(正常氧)氧下培养MSCs,对目的细胞分别进行ALP活性分析,实时PCR指定基因表达分析, ARS着色矿化检测；在MSCs分化过程中通过实时PCR在7天、14天、21天的时候检钡(?)Notch1的表达水平,通过免疫印迹检钡(?)Notch1的蛋白表达水平；Notch1专一性的慢性病毒调节shRNA注入MSCs以抑伟(?)Notch(?)言号活性；在成骨诱导条件下培养7天以后,观测ALP活性、Runx2、OPN和OCN的mRNA表达水平及成骨矿化水平；在低氧和正常氧条件下测量Runx2在对照Notch1-shRNA转染MSCs中和Notch1-shRNA转染MSCs中蛋白表达水平；免疫沉淀实验研究Notch1和Runx2的关系；使用骨钙素和纤连蛋白启动子荧光素酶实验测Runx2的转录活性。 结果：体外培养后细胞的ALP活性在低氧条件下比正常氧条件下低很多(p0.01)；实验组低氧组中三种基因的表达水平比正常氧条件下低很多(p0.01)；相应的,在形态学表现上,低氧条件下培养的MSCs分化的矿化水平相比正常氧条件下显著降低(p0.01)。实时PCR在7天、14天、21天的时候检测(?)Notch1的表达水平发现与正常氧相比,Notch1(?)勺表达在低氧条件下显著升高。和(?)mRNA水平一致,Notch1在低氧条件下培养的MSCs7天、14天、21天各个时间点中的蛋白表达水平显著增加。Notch1专一性的慢性病毒调节shRNA被注入MSCs来抑制Notch信号活性。Notch1的表达被shRNA明显抑制。当Notch1shRNA和控制shRNA转化的MSCs在成骨诱导条件下培养7天以后,在对照组细胞中,ALP活性在低氧条件下比在正常氧条件下低很多；在Notch1抑制的细胞中,ALP活性差异在两种条件下不明显。除此之外,Runx2, OPN和OCN的mRNA表达水平在控制(?)shRNA转化组中低氧和正常氧下差别很大,但在Notch1shRNA转化组中就不明显。相同的,矿化水平差异在shRNA转化细胞中不明显,但是在对照组中就很明显。我们进一步研究了低氧通过Notch信号抑制MSCs成骨分化的机制。基于Runx2对于成骨细胞分化是很关键的转录因子,在低氧和正常氧条件下测量Runx2在对照Notch1-shRNA转染MSCs中和Notch1-shRNA转染MSCs中蛋白表达水平。不管是在低氧还是正常氧条件下,Notch1抑制都可导致Runx2的上调。另外,免疫沉淀实验显示Notch1可以绑定在Runx2上。为了进一步研究Notch1和Runx2之间绑定的功能性结果,在对照组和Notch1shRNA转染组中Runx2的转录活性通过使用骨钙素和纤连蛋白启动子荧光素酶实验测定。Runx2的转录活性在Notch1抑制后显著提高。 结论：低氧抑制MSCs成骨分化；在MSCs的成骨分化过程中低氧可激活Notch信号；Notch信号对于MSCs成骨分化的低氧性损伤是必须的；Notch通过直接绑定在Runx2上抑制Runx2的转录活性。
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 余国建;间充质干细胞分化成骨的研究[J];国外医学.口腔医学分册;2004年S1期

2 梁雪;孔佩艳;;骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景[J];西部医学;2007年05期

3 朱付平,熊光仲,王万春,卢敏;骨髓间充质干细胞在骨科中应用的研究进展[J];中国中医骨伤科杂志;2005年05期

4 王珍,徐根波;骨髓间质干细胞及其临床应用的研究进展[J];中国肿瘤;2005年11期

5 王彤;;美国心脏学会2007年年会及心肺复苏最新成果介绍[J];中国急救医学;2008年01期

，

本文编号：2694691