多顺反子质粒载体重编程脂肪间充质干细胞为诱导多能干细胞

发布时间：2020-06-03 17:05

【摘要】：诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是通过向分化的体细胞转入特定的外源转录因子进行重编程,从而获得具有自我更新能力和多能性的细胞。iPSCs具有形成体内所有细胞类型的潜能,尤其是能以患者自身体细胞制备iPSCs可用于特定疾病的治疗,不但能解决干细胞临床应用所遇到的免疫排斥问题和伦理医学等难题,而且在基础研究、再生医学以及药理科学中也有着广阔的发展前景和重要的意义。目前,iPSCs的来源主要是将细胞导入外源基因进行重编程而获得。但是根据细胞种类的不同,所采用的具体基因组合和转基因方式各不相同,获得的iPSCs的质量也不尽相同,存在着安全性等方面的隐患。为提高产生iPSCs的安全性,本研究采用多顺反子质粒载体在无饲养层细胞条件下重编程脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)获得iPSCs,旨在为再生医学的深入研究和应用提供更安全便利的细胞源。首先,构建了两种多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。以分别实现四因子和两因子多顺反子质粒载体转染人ADSCs的目标。先以重叠PCR方法将酶切位点(EcoR I、SaL l和BamH I)与具有自我剪切功能的2A元件(P2A、T2A和E2A)序列插入至Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列之间；再将各个基因片段连接(Oct4-P2A-Sox2-T2A-Klf4-E2A-c-Myc, OSKM)构建成单个开放阅读框(open reading frame, ORF);最后以双酶切、连接的方式插入pIRES2-EGFP质粒载体,构建成携带四因子的多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP.随后以Nhe I酶切pIRES2-OSKM-EGFP作为模板,利用PCR方法克隆Oct4-P2A-Sox2片段,再以重叠PCR方法在Oct4-P2A-Sox2序列两端添加酶切位点Nhe I和Sac I,然后以双酶切、连接的方式插入pIRES2-EGFP质粒载体,构建成携带Oct4和Sox2两个基因的多顺反子质粒载体pIRES2-OS-EGFP。经过设计特异引物进行PCR反应和测序鉴定,证实所构建的两种多顺反子质粒载体序列正确。因此,本实验成功采用2A元件构建了两种质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。然后,先使用构建的四因子多顺反子质粒pIRES2-OSKM-EGFP载体转染人ADSCs,在无饲养层细胞条件下将其重编程为iPSCs。首先分离培养ADSCs,将传代培养至第四代的ADSCs用pIRES2-OSKM-EGFP质粒载体转染一次,间隔4天后进行第二次转染。光学显微镜下观察,在转染后的3～4周,当有明显的细胞克隆出现时,将集落边缘界限清晰的细胞克隆进行挑取,并分离传代培养与鉴定。对重编程细胞的相关检测结果表明：细胞克隆的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)表现为阳性；定量RT-PCR检测内源性多潜能相关基因Oct4、Sox2、 Klf、 c-Myc和TERT的mRNA呈高水平表达；免疫荧光细胞化学显示其表达多能性标志蛋白分子Oct4、 Nanog、TRA-1-60和SSEA4;细胞保持正常核型。更重要的是,Southern blot检测结果表明,无质粒载体序列插入／整合到iPSC基因组中。此外,体外分化实验证实可形成拟胚体(embryonic bodys, EBs)并具有分化成三胚层细胞类型的能力；体内分化实验则表明,该细胞可形成畸胎瘤并具有分化形成三个胚层组织的能力。因此,本实验成功使用多顺反子质粒载体转染了ADSCs,并将其重编程为iPSCs;经过细胞特异性标记基因检测和分化能力检测,证实iPSCs具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)的形态与功能。接着,使用仅携带两个多能性因子Oct4和Sox2的多顺反子质粒pIRES2-OS-EGFP载体转染ADSCs并将其重编程为具备多能性细胞特点与功能的iPSCs.先以pIRES2-OS-GFP质粒载体第一次转染ADSCs细胞,以转染当天计为向iPSCs诱导的第0天,在第7天后进行第二次转染。在含有4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干细胞培养液中培养传代,21天后逐步分离出集落边缘界限清晰的细胞克隆。高倍镜下集落中的单个细胞核较大,核质比例较高；细胞集落生长稳定,核型正常；AP检测其为阳性；免疫细胞化学检测细胞表达Oct4、Nanog、 TRA-1-60和SSEA4; RT-PCR检测其表达ESCs的标志基因。经体内体外分化实验,可分别检测到形成三个胚层的EBs和畸胎瘤,并且无质粒载体序列插入／整合至iPSCs基因组中。上述实验结果显示,只采用多顺反子质粒载体携带Oct4和Sox2两个转录因子转染ADSCs,仍然可以使其重编程为iPSCs。最后,使用多顺反子质粒pIRES2-OSKM-EGFP载体重编程ADSCs获得多能性后,又进行了该细胞向神经细胞诱导分化的研究。先使用质粒载体对传代至第六代的ADSCs转染操作,以转染操作当天计为第0天。为达到更高转染效率,细胞培养4天后进行第二次转染。在第一次转染后的第7天,将原来的ADSCs生长培养基更换为添加G418药物的筛选培养基；一周后,更换为不含有G418药物的培养基。细胞进行药物筛选后继续培养。相关结果表明：经免疫荧光细胞化学检测,重编程细胞表达多能性蛋白标记Oct4、 Nanog、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4; RT-PCR结果显示,细胞不仅表达多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,还表达ESCs多能性特异基因REX1和TERT;细胞核型正常,无质粒载体序列插入／整合到iPSCs基因组中。而且,将重编程的多能细胞培养在神经诱导分化培养基中,并经过3周的诱导培养后,细胞表达神经细胞相关蛋白标志分子Nestin、GFAP、TUJl、RIP和Nurrl。进而通过免疫细胞化学技术,在培养板中随机选取不同视野,计算了表达不同蛋白标志分子阳性细胞与总细胞数目比例,结果显示：GFAP70.5±8.0%(n=258)、 TUJ182.7±7.3%(n=266)、RIP60.4±5.2%(n=212)和Nurr173.6±9.2%(n=244).因此,本试验经过细胞形态和标志分子表达检测,成功诱导了ADSCs来源的多能细胞,并使其向神经细胞发生了分化。本研究分别构建多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP,在无饲养层细胞条件下分别重编程ADSCs获得iPSCs,提高了所产生的iPSCs的安全性。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416

【参考文献】