小鼠TLR-2的克

发布时间：2020-06-03 22:08

【摘要】：哺乳动物Toll like receptors(TLRs)是果蝇Toll的同系物，它们构成一个新的蛋白家族，参与天然免疫的介导和获得性免疫的激活。自1997年发现第一个哺乳动物TLRs以来，现已发现了小鼠的TLRs有9个(即mTLR1-9)；人的TLRs有10个(即TLR1-10)中。研究表明，TLRs家族的作用并不仅限于抗感染免疫，还可参与抗原递呈、诱导免疫耐受、细胞凋亡，并以此在自身免疫病、超敏反应、移植排斥及肿瘤免疫中发挥作用。在过去几年中，TLR-2作为脊椎动物蛋白TLR家族的一员，得到广泛的研究。TLR-2可介导多种不同的病原微生物(尤其是革兰氏阳性菌、分枝杆菌及螺旋体等)及其产物引起的、性质相似的细胞信号转导活动及细胞因子产生。因此,TLR-2被认为是具中心作用的或中枢型识别(central pattern recognition)受体。尽管有许多体外实验证实了TLR-2参与免疫相关事件，但是来自体内实验关于TLR-2功能的数据很少。 小鼠和人的TLR-2都是果蝇TLR-2的同源蛋白，两者在氨基酸水平上有83％的同源性。基于mTLR-2与hTLR-2结构的高度同源性，及在分布、生物学活性方面的诸多相似，小鼠无疑是研究TLR-2结构、功能及其结合肽特性的良好模型。本研究拟对小鼠TLR-2进行克隆、表达及其抗体的生物活性研究。首先对小鼠TLR-2的全基因及部分基因进行克隆、表达；制备抗mTLR-2胞外段B细胞识别表位抗体；在获得了抗mTLR-2抗体的基础上，进行抗mTLR-2抗体抗过敏和肿瘤抑制实验，从整体水平上来研究TLR-2的生物学功能。 第一部分 mTLR-2基因的克隆及在不同体系中的表达 根据已发表的mTLR-2的全基因序列，采用Primer premier 5.0软件，设计并合成以下两对引物。以P2,P4为引物，以Balb／c小鼠肝脏eDNA为模板的PCR反应，扩增出约1500bp特异性扩增带，而以P1,P3为引物的PCR反应，扩增出约1400bp特异性扩增带通过蓝白斑筛选挑选，并经PCR和测序鉴定，分别获得上游阳性克隆U3和下游阳性克隆D4。以 u3、04为模板，以PZ，P4为引物的pCR反应，扩增出约2 soobp特异性 扩增带，将其克隆至puCm一T载体中，经PcR和测序鉴定，获得 puc一mTLR一2重组质粒。经测序鉴定，表明获得mTLR一2基因，该序列 已被GenBank收录(AY179346)，与已发表的mTLR一2的同源性为99.84%。 在线运行BLASTZ，AY179346与标准mTLR一2 eDNA序列AF124741之 间有4个碱基的差别。分别是515位由t变为c，963位由t变为c位， 2476位由a变为g，2500位由t变为。由AY179346推导而来的氨基酸 与AF 124741所编码的氨基酸序列比较，有3个氨基酸的差异，分别是 F266L，Q770R，L778P。 从体外获取mTLR一2蛋白，对于从细胞模型及动物模型进行TLR一2 的研究具有重要意义。选用哺乳动物CHO细胞表达系统、毕赤酵母表达 系统及大肠杆菌原核表达系统对全长及部分mTLR一2基因进行表达研 究。(l)将目的基因克隆到真核表达载体peDNA3 .1中，成功构建了 PcDNA一mTLR一2重组质粒，并将其转染到CHo细胞，用G418筛选阳性 克隆。PCR检测表明外源基因得到稳定整合，Westem blot分析显示在 分子量约95 000处可见清晰的阳性反应条带。免疫组织化学和流式细胞 术检测显示转染细胞表达mTLR一2。(2)将目的基因编码序列插入毕赤酵 母表达载体pPICZac中，获得重组质粒pPIcz一mTLR一2，采用电穿孔法 转化毕赤酵母。重组酵母以PeR、RT一PCR验证，sDs一AGE和Westem blot 分析显示，在相对分子量为约97 000处有1特异蛋白带，且能与抗 mTLR一2多抗发生反应。(3)采用PcR技术，扩增编码mTLR一ZN端153 氨基酸的基因，并将其克隆到pET32a载体中，成功构建了融合表达载体 pET一，融合蛋白在大肠杆菌中高效表达，采用Probond树脂柱纯化融合 蛋白。 第二部分抗mTLR一2胞外段抗体的制备与鉴定 制备两种抗mTLR一2胞外段抗体。(1)在对小鼠Toll样受体 2(mTLR一2)B细胞优势表位预测的基础上，合成B细胞识别表位20mer短 肤，将其与载体蛋白偶联，制备免疫原。经ELISA方法检测抗体滴度为 1:25 600，采用spG柱纯化法获得兔抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位 多克隆抗体TSP一1;采用抗原肤亲和层析纯化法获得兔抗mTLR一2胞外 段B细胞识别表位抗体TSP一2。Westem blot分析显示在相对分子量约 95 000处可见清晰的反应条带;免疫组织化学和流式细胞术检测显示抗 体可与表达天然mTLR一2的J774A.1细胞反应。(2)将已获得的N端融合 蛋白免疫动物，获取抗mTLR一2多表位抗体。经ELISA方法检测抗体滴 度为1:16 000，采用spG柱纯化法获得兔抗mTLR一2胞外段B细胞识别 表位多克隆抗体TsP一3。流式细胞术检测显示TsP一3可与25.5%的 CHO一mTLR一2细胞反应。 第三部分抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位抗体抑制肉瘤生长的研究 以小鼠肉瘤株5180细胞注射小鼠左后肢，其中TSP一l组混合有100 雌纯化抗体TSP一1，RlgG组混合有100雌正常兔lgG，Sahne组仅接种 5180。小鼠经麻醉分别于10d、14d、18d处死，TSP一l组瘤重在10d、14d、 18d与Saline组相比差异显著(p0.02、p0.05、P0.05);抑瘤率分别 为77%、51%和53%。局部应用抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位抗 体可抑制小鼠肉瘤5180生长，且主要表现在肿瘤生长的早期。
【图文】：

26901882图1一6pcDNA一InTLR一2的琼脂糖凝胶电泳鉴定Fig.1一IdentineationofPeDNA一mTLR-2byagarosegeleleetroPhoresisM:入尸EeoT141Markerl:PeDNA一mTLR一2/Notl+Xbal2:PCRProductofPeDNA一mTLR-2二、G418筛选细胞经G418持续筛选，未转染细胞一周内全部死亡，两周时转染细胞大部分死亡，持续加压三周可见散在的G418抗性细胞克隆(图1一7)。图1一7G418筛选单克隆细胞Fig.l一7SereeningofmonoclonaleellbyG418A:nonnalCHOeellB:monoelonaleellseleetedbyG418一23-

三、PCR检测外源基因的整合PCR扩出2350bp左右的目的带，表明外源基因得到稳定整合(图1一8)。麟，图1一8外源基因整合的PCR鉴定Fig.l一8PCRanalysisofexogenousgeneM:DL15000Markerl:CHOeell。’ansfectedwithpeDNA一TLR-2四、转染细胞表达鉴定在以抗mTLR-2多克隆抗体TSP一1为一抗的mTLR-2表达检测中，转染细胞裂解液的Westemblot检测发现，在分子量约95000处可见清晰的阳性反应条带，表明转染细胞中有mTLR-2的表达(图1一9)。免疫组织化学检测显示，转染细胞出现较强的棕黄色着色，未转染细胞无棕黄色着色(图1一10)。FCM检测显示，41.9%以上转染细胞，对照细胞仅有5%有荧光反应(图1一11)。以上结果充分表明转染细胞表面存在mTLR一2。卜班令
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 张家祥,连莲淑;静脉注射丙种球蛋白治疗过敏性紫癜顽固性皮疹26例疗效观察[J];福建医药杂志;2001年05期

2 徐培君,孙书方,顾冠彬,万海燕;链球菌制剂SM对S180荷肉瘤小鼠的抑瘤作用[J];苏州大学学报(医学版);2002年03期

3 杨U，

本文编号：2695466