线粒体融合蛋白2对大鼠骨骼肌L6肌细胞GLUT4表达及转位的影响

发布时间：2020-06-04 03:41

【摘要】：线粒体作为细胞能量代谢的核心，其结构和功能的改变与胰岛素抵抗的发生和发展密切相关。然而，线粒体缺陷是胰岛素抵抗的原因，结果，还是其中的一个伴随过程，目前仍有争议。事实上，最早的关于线粒体功能与糖尿病之间相关性的研究是van den Ouweland JM等于1992年发现的线粒体DNA突变可导致母系遗传性糖尿病。目前，关于二者相关性的众多研究更倾向于线粒体功能的缺陷是继发于胰岛素抵抗而发生的，而非其始动因素。但是随着线粒体氧化及磷酸化能力的下降，胰岛素抵抗的程度也随之增加，因此可以推断线粒体功能的缺陷是加剧胰岛素抵抗的原因之一。线粒体融合蛋白2（mitofusin2, Mfn2）是位于线粒体外膜上的一种跨膜蛋白，它促进了线粒体的融合，并且参与了线粒体代谢的调节。其表达具有组织特异性，在骨骼肌、心肌及大脑等高能量代谢组织中高表达。近期的研究提示Mfn2在葡萄糖稳态的维持中起到了重要的作用，此外，Mfn2表达的缺陷可能是胰岛素抵抗发生的潜在病理生理机制之一。研究发现，在Mfn2/shRNABALB/c小鼠中，早期即出现胰岛素抵抗，同时伴有肝葡萄糖生成增加。Sebastian D等发现Mfn2缺失可引起线粒体功能障碍，活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）生成增加，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）活性增强，而胰岛素信号通路的关键分子胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1, IRS-1）失活。骨骼肌细胞中Mfn2功能的获取增加了葡萄糖氧化率及线粒体膜电位，而线粒体膜电位的增加说明线粒体丙酮酸氧化作用的增强及三羧酸循环和氧化磷酸化的增强。最近，有学者提出在非糖尿病及糖尿病个体中Mfn2表达与胰岛素敏感性之间存在着正相关关系。无论是在健康个体还是在2型糖尿病患者中，骨骼肌对葡萄糖的摄取和利用在全身葡萄糖稳态的调节中都发挥了重要的作用。葡萄糖的摄取是葡萄糖代谢过程中的主要限速步骤，在骨骼肌中这一过程主要由葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter4, GLUT4）完成。GLUT4是葡萄糖转运蛋白家族(GLUTs)中的一员，主要存在于骨骼肌和脂肪组织中。GLUT4表达减少或转位障碍直接导致骨骼肌对葡萄糖的摄取障碍，最终导致高血糖。GLUT4的转运主要是通过两个独立的信号途径完成，一为胰岛素依赖的信号途径（PI3K-Akt途径），另一条为非胰岛素依赖的信号途径（AMPK途径）。研究发现全身葡萄糖的摄取与骨骼肌中GLUT4的表达呈正相关关系。GLUT4的表达可通过调节GLUT4启动子区的肌细胞增强子2（myocyte enhancer factor2, MEF-2）来实现，其中组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)、过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator1α, PGC-1α）及p38均可通过MEF-2来调节GLUT4的表达。SriwijitkamolA等报道在肥胖的胰岛素抵抗大鼠中存在不同程度的AMPK-PGC-1α信号通路的异常，并且认为AMPK可能是通过PGC-1α诱导GLUT4蛋白表达。随后Leick L等证实了这一观点，研究发现AICAR干预（AMPK激动剂）可诱导野生型小鼠GLUT4蛋白表达增加，而在PGC-1α敲除小鼠中无此改变，进一步肯定了AMPK-PGC-1α途径在调节GLUT4表达中的重要作用。最近在一项关于糖尿病减肥手术的临床研究中发现，6名病态肥胖女性患者通过手术成功减重之后Mfn2mRNA表达水平升高，同时伴有GLUT4mRNA表达上调及全身葡萄糖的摄取增加，并且Mfn2mRNA与GLUT4mRNA表达存在正相关关系。然而Mfn2在葡萄糖摄取方面的更深入的研究目前尚未见报道。我们前期的研究发现，高脂饮食喂养所致胰岛素抵抗的大鼠模型中骨骼肌Mfn2及GLUT4表达减低。国外亦有报道，在肥胖和2型糖尿病患者骨骼肌中同样存在Mfn2及GLUT4的表达减低，且两者之间存在正相关关系。那么在整体动物模型中，Mfn2过表达能否抗衡病理条件，改善大鼠胰岛素抵抗呢？本研究通过高脂饮食构建大鼠胰岛素抵抗模型，观察Mfn2腺病毒干预后对大鼠胰岛素敏感性的变化及对骨骼肌GLUT4表达及转运的影响；通过腺病毒转染L6肌细胞，在细胞实验中进一步验证Mfn2对GLUT4表达及转运的影响，进一步探讨Mfn2影响GLUT4表达及转运的具体机制。本实验内容主要包括以下三部分：第一部分Mfn2对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表达及转运的影响目的：Mfn2过表达对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性及骨骼肌GLUT4表达及转运的影响方法：40只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为4组，正常对照组(NC, n=10)、高脂饮食组(HF, n=10)、高脂+空病毒组(HF+Ado, n=10)、高脂+Mfn2腺病毒组(HF+AdMfn2, n=10)，NC组给予普通饲料喂养，HF组、 HF+Ado组及HF+组给予高脂饲料喂养8周，实验第8周末应用清醒状态下高胰岛素正葡萄糖钳夹实验评价各组大鼠胰岛素抵抗程度。实验第9周开始，NC组、HF组、HF+Ado组及HF+AdMfn2组分别接受0.1ml生理盐水、生理盐水、Ado、AdMfn2经尾静脉注射，每周1次，共3周。病毒浓度为1×1010pfu/ml。实验第11周末再次行高胰岛素正葡萄糖钳夹实验评价各组大鼠胰岛素抵抗程度。实验结束前取血用于生化指标的测定，之后处死各组大鼠，留取骨骼肌组织标本于-80°C低温冰箱保存。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法检测骨骼肌Mfn2及GLUT4mRNA的表达。Western blot方法检测骨骼肌Mfn2、胰岛素受体β（IRβ）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、p-AMPKα及GLUT4蛋白的表达。结果：1、大鼠空腹血糖、血清胰岛素及游离脂肪酸的比较：高脂饮食干预11周后，大鼠空腹血葡萄糖、胰岛素及游离脂肪酸水平HF组、HF+Ado组明显高于NC组，差异有统计学意义（P0.05）；HF+AdMfn2组与NC组相比无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。HF+Ado组与HF组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05），HF+AdMfn2组明显低于HF组，差异有统计学意义（P0.05）。2、大鼠葡萄糖输注率（GIR）的比较：高脂饮食喂养11周后，葡萄糖输注率（GIR）HF组明显低于NC组，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预后GIR明显增加，HF+AdMfn2组较HF组增加了67%，差异有统计学意义（P0.05），而HF+Ado组较HF组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。3、Mfn2mRNA和蛋白表达变化的比较：高脂饮食喂养11周后，HF组Mfn2mRNA和蛋白水平表达明显下降，分别为NC组的51%和44%，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预后，HF+AdMfn2组Mfn2mRNA和蛋白水平分别为HF组的3.4和3.3倍，差异有统计学意义（P0.05），而HF+Ado组较HF组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。4、GLUT4mRNA和蛋白表达变化的比较：高脂饮食喂养11周后，HF组GLUT4mRNA和蛋白水平表达明显下降，分别为NC组的56%和66%，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预后，HF+AdMfn2组GLUT4mRNA和蛋白水平分别为HF组的1.49和1.31倍，差异有统计学意义（P0.05），而HF+Ado组较HF组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。5、AdMfn2干预对GLUT4转位的影响：与NC组相比，HF组骨骼肌组织中膜蛋白与总蛋白比值（PM/T）明显降低，差异有统计学意义（P0.05）；与HF组相比，AdMfn2干预后HF+AdMfn2组PM/T比值为HF组的1.87倍，差异有统计学意义（P0.05）；而这一比值在HF+Ado组和HF组中无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。6、AdMfn2诱导GLUT4转位过程中Akt及AMPK信号通路蛋白表达的变化：与NC组相比，HF组IRβ、PI-3K、p-Akt和Akt蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P0.05）；而在HF组、HF+Ado组和HF+AdMfn2组中上述指标无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。与NC组相比，HF组p-AMPKα蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P0.05）；HF+Ado组与HF组相比无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。AdMfn2显著增加了AMPKα的磷酸化水平，HF+AdMfn2组p-AMPKα蛋白表达水平为HF组的2.76倍，差异有统计学意义（P0.05），但总的AMPKα蛋白表达水平各组间无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。结论：1、高脂饮食使大鼠空腹血糖、胰岛素及游离脂肪酸水平升高，葡萄糖输注率下降，导致胰岛素抵抗，Mfn2过表达可改善高脂饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗。2、高脂饮食可使大鼠骨骼肌Mfn2表达下降，Mfn2过表达可使骨骼肌Mfn2表达上调。3、高脂饮食可使大鼠骨骼肌GLUT4的表达及转位减少，Mfn2过表达可使骨骼肌GLUT4的表达及转位上调。4、Mfn2过表达在增加GLUT4转位的同时，伴有AMPK磷酸化水平增加，而Akt磷酸化水平无明显变化。Mfn2过表达可能通过AMPK磷酸化增加的方式增加了GLUT4的转位，从而改善了胰岛素敏感性。第二部分Mfn2对L6肌细胞GLUT4表达的影响目的：通过腺病毒转染siMfn2及AdMfn2干预L6肌细胞，观察L6肌细胞GLUT4蛋白的表达情况，明确Mfn2表达对GLUT4蛋白表达的影响。方法：将L6细胞接种于含10%FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2饱和培养箱中常规培养，每2-3天传代一次，待细胞进入对数生长期后将含10%FBS的培养基换成含2%FBS的培养基诱导细胞分化，共7天。分后成功后，实验分为四组：①正常对照组(NC group)②正常+空病毒组(Ado group)③正常+小干扰RNA病毒组(siMfn2group)④正常+Mfn2腺病毒组(AdMfn2group)。L6肌细胞分化成功后，换用含0.5%FBS的DMEM培养基，以100pfu/cell (100MOI)的浓度分别加入Ado、siMfn2或AdMfn2转染孵育24h，实验结束前加入胰岛素（终浓度为100nM）孵育10min，收集细胞用于实验。应用Western blot方法检测L6肌细胞Mfn2、AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α及GLUT4蛋白的表达。结果:1、siMfn2及AdMfn2干预对Mfn2蛋白表达影响的比较:siMfn2干预24小时后，L6肌细胞Mfn2蛋白水平明显下降，siMfn2组约为NC组的13.9%，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预24小时后，L6肌细胞Mfn2蛋白表达水平明显增加，AdMfn2组约为NC组的2.61倍，差异有统计学意义（P0.05）。为排除病毒转染对细胞的影响，，以空病毒作为对照，Ado组与NC组相比无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。AdMfn2组Mfn2蛋白表达水平较siMfn2组明显升高，差异有统计学意义（P0.05）。2、siMfn2及AdMfn2干预对p-AMPKα及AMPK蛋白表达影响的比较:siMfn2干预24小时后，L6肌细胞p-AMPKα蛋白水平明显下降，siMfn2组约为NC组的61.1%，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预24小时后，L6肌细胞p-AMPKα蛋白表达水平明显增加，AdMfn2组约为NC组的1.49倍，差异有统计学意义（P0.05）。Ado组与NC组相比无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。AdMfn2组p-AMPKα蛋白水平较siMfn2组明显升高，差异有统计学意义（P0.05）。各组间AMPKα蛋白表达无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。3、siMfn2及AdMfn2干预对PGC-1α蛋白表达影响的比较:siMfn2干预24小时后，L6肌细胞PGC-1α蛋白水平明显下降，siMfn2组约为NC组的32.4%，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预24小时后，L6肌细胞PGC-1α蛋白表达水平明显增加，AdMfn2组约为NC组的1.95倍，差异有统计学意义（P0.05）。Ado组与NC组相比无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。AdMfn2组PGC-1α蛋白水平较siMfn2组明显升高，差异有统计学意义（P0.05）。4、siMfn2及AdMfn2干预对GLUT4蛋白表达影响的比较:siMfn2干预24小时后，L6肌细胞GLUT4蛋白水平明显下降，siMfn2组约为NC组的54.5%，差异有统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预24小时后，L6肌细胞GLUT4蛋白表达水平明显增加，AdMfn2组约为NC组的1.62倍，差异有统计学意义（P0.05）。Ado组与NC组相比无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。AdMfn2组GLUT4蛋白水平较siMfn2组明显升高，差异有统计学意义（P0.05）。结论：在L6肌细胞中，上调Mfn2表达可使AMPK磷酸化水平增加，PGC-1α蛋白表达增加，GLUT4蛋白表达增加；下调Mfn2表达后，随着Mfn2表达的下降，p-AMPK、PGC-1α及GLUT4的表达均随之出现下调。第三部分AMPK在Mfn2诱导的GLUT4表达及转位中的作用目的：通过AdMfn2腺病毒转染干预L6肌细胞，并加入compound C（AMPK抑制剂），观察L6肌细胞中GLUT4表达及转位的变化，明确AMPK对GLUT4蛋白表达及转位的影响。方法：将L6细胞接种于含10%FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2饱和培养箱中常规培养，每2-3天传代一次，待细胞进入对数生长期后将含10%FBS的培养基换成含2%FBS的培养基诱导细胞分化，共7天。实验分为四组：①正常对照组(NC group)②正常+Mfn2腺病毒组(AdMfn2group)③正常+compound C组(CC group)④Mfn2腺病毒+compound C组(AdMfn2+CC group)。L6肌细胞分化成功后，加入compound C10uM孵育30min,然后以100pfu/cell(100MOI)的浓度加入AdMfn2转染孵育24h，实验结束前加入胰岛素（终浓度为100nM）孵育10min，收集细胞用于实验。应用Western blot方法检测L6肌细胞Mfn2、AMPKα、p-AMPKα、Akt、p-Akt、PGC-1α及GLUT4蛋白的表达。结果：1、AdMfn2及compound C干预对Mfn2蛋白表达影响的比较：AdMfn2干预24小时后，L6肌细胞Mfn2蛋白表达水平明显增加，AdMfn2组约为NC组的3.0倍，差异有统计学意义（P0.05）。CC组较NC组略有降低，差异有统计学意义（P0.05）。compound C和AdMfn2共同干预后，AdMfn2+CC组较NC组相比Mfn2蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P0.05）；但较AdMfn2组相比降低，差异有统计学意义（P0.05）。2、AdMfn2及compound C干预对p-AMPKα及AMPK蛋白表达影响的比较：AdMfn2干预24小时后，AdMfn2组较NC组相比p-AMPKα蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。compound C单独干预及compound C加AdMfn2共同干预后，CC组和AdMfn2+CC组p-AMPKα蛋白表达水平较NC组降低，差异有统计学意义（P0.05）；同样低于AdMfn2组，差异有统计学意义（P0.05）。而AdMfn2+CC组与CC组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。各组间AMPKα蛋白表达无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。3、AdMfn2及Compound C干预对p-Akt及Akt蛋白表达影响的比较：各组间p-Akt及Akt蛋白表达均无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。4、AdMfn2及Compound C干预对GLUT4转位影响的比较：AdMfn2干预24小时后，AdMfn2组较NC组相比GLUT4膜蛋白的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。compound C单独干预及compound C加AdMfn2共同干预后，CC组和AdMfn2+CC组GLUT4膜蛋白表达水平较NC组降低，并且也低于AdMfn2组，差异有统计学意义（P0.05）。而AdMfn2+CC组与CC组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。AdMfn2干预24小时后，AdMfn2组较NC组相比GLUT4总蛋白的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。compound C单独干预及compound C加AdMfn2共同干预后，CC组和AdMfn2+CC组GLUT4总蛋白表达较NC组降低，并且也低于AdMfn2组，差异有统计学意义（P0.05）。而AdMfn2+CC组与CC组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。GLUT4膜蛋白与总蛋白的比值各组间无明显差异，差异无统计学意义（P0.05）。5、AdMfn2及compound C干预对PGC-1α蛋白表达影响的比较：AdMfn2干预24小时后，AdMfn2组较NC组相比PGC-1α蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。compound C单独干预及compound C加AdMfn2共同干预后，CC组和AdMfn2+CC组PGC-1α蛋白表达水平较NC组降低，差异有统计学意义（P0.05）；同样低于AdMfn2组，差异有统计学意义（P0.05）。而AdMfn2+CC组与CC组相比无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。结论：1.AdMfn2腺病毒转染L6肌细胞可上调细胞Mfn2表达，加入AMPK抑制剂compound C干预后，Mfn2表达略有下降。2. Mfn2可增加AMPK磷酸化水平，应用AMPK抑制剂compound C干预后，此作用消失。3. Mfn2及compound C均不影响Akt的磷酸化水平。4. Mfn2可上调GLUT4蛋白的表达，并且是通过AMPK-PGC-1α途径实现的。5. Mfn2对GLUT4的转位不依赖于AMPK。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

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