CASK-Id1信号通路在细胞增殖中的作用

发布时间：2020-06-04 01:32

【摘要】：血管内皮细胞不仅仅是血液和组织间的一道机械屏障，而且是一个动态的、异质的、播散分布的器官，具有重要的分泌、合成、代谢和免疫功能。血管内皮细胞是创伤、感染、休克、心血管疾病、肿瘤等多种疾病中极易受损的细胞，同时也是参与机体应激反应、创伤组织修复的重要成员，其增殖和分化的相互协调是烧伤、创伤后创面愈合和修复关键因素之一。 本室前期研究发现：人钙／钙调蛋白依赖的丝氨酸蛋白激酶(CASK)可以抑制血管内皮细胞株ECV304细胞的增殖，而其调节血管内皮细胞增殖的作用机制尚不清楚，对此深入探讨将有助于我们对创伤修复等涉及血管发生、重建的病理生理现象的理解。 CASK的主要功能是作为一个支架蛋白质参与细胞膜蛋白骨架的构建，细胞连接的形成，以及调节功能蛋白质的分布，参与细胞的信号传导和基因调控等。我们发现，人血管内皮细胞株ECV304中CASK能够与分化抑制因子1(Id1)相互作用。Id家族属于HLH蛋白，其结构中不含有与DNA特异性结合的碱性区，与很多bHLH转录因子结合形成无功能活性的异二聚体，是bHLH家族的负调控因子，在细胞增殖和分化的调节中具有重要作用。CASK与Id1在物理结构上存在相互作用提示两者可能在生物学功能上有所关联。本室对此做了一些探索性工作，我们发现，过表达CASK的ECV304细胞的生长率显著降低，细胞周期依赖性激酶抑制因子p16、p21表达上调，我们推测CASK过表达后所观察到的细胞增殖抑制现象可能与Id1有关，为了进一步验证以上推测和深入了解CASK抑制细胞增殖的信号机制，我们从几个方面进行了初步探索。 本室前期的研究已经成功构建了CASK过表达的ECV304细胞，本课题主要承担CASK缺陷表达ECV304细胞模型的建立以及CASK影响细胞增殖的细胞内信号机制研究。采用近年发展起来的RNA干扰技术(RNAi)，应用质粒载体介导的细胞内小干扰RNA(siRNA)表达策略，共设计和成功构建7个siRNA表达质粒，分别对应于靶基因CASK、Id1，报告基因萤火虫荧光素酶、EGFP和GFP，全部经测序验证。 首先通过重组siRNA表达质粒对外源报告基因EGFP和萤火虫荧光素酶的抑制效果，确认了载体介导的RNAi策略在ECV304细胞中应用的可行性。根据蛋白和mRNA 第三军医大学博士学位论文 水平的阻断效率，筛选出对内源性靶基因CASK和Idl抑制效率较高的重组质粒。应用 RNAi方法抑制CASK表达，ECV3O4细胞生长加快，而CASK过表达，ECV304细胞生 长受到一定的抑制，实验从正调节和负调节两个方向证明，CASK能够参与ECv304细 胞增殖的抑制信号。流式细胞术分析表明，应用RNAi方法抑制CASK表达，ECV304 细胞的增殖指数(PI)明显高于对照组，细胞较多地进入有丝分裂期和DNA合成期，这 从另一个侧面说明，CASK是ECV3O4增殖的负调控分子。 本研究结果显示，CASK过表达时，Idl与其拼接型Idl’的mRNA组成比例发生 显著的改变，Idl逐渐减少，而Idl’逐渐增高。我们推测CASK调节Idl和Idl’的组 成比例可能是CASK抑制细胞增殖的原因之一。同时，细胞计数实验结果表明，抑制 Idl表达削弱了CASK对细胞增殖的影响，提示Idl参与了CASK抑制细胞增殖的信号。 Idl分子通过与bHLH类转录因子形成无功能活性的异二聚体而抑制bHLH家族 转录因子的活性，有研究证实，周期素依赖的蛋白激酶抑制因子pl6和pZI在哺乳动 物细胞中受bHLH转录因子和Idl分子的共同调节，因此我们观察了CASK下调表达 情况下P16和/或pZI的表达。实验结果表明，以RNAi方法抑制cAsK的表达，P16 和P21的表达也受到了明显的抑制，这提示cAsK抑制细胞增殖的生物学效应可能是 通过pl6和/或pZI影响细胞周期转换而实现的。 为深入探讨CAsK影响pl6和pZI表达的机制，我们研究了cAsK表达抑制或者 增强的情况下，ldl与bHLH转录因子家族成员EZA形成二聚化的定量改变，结果表明， 当CASK表达增加时，与EZA分子免疫共沉淀的Idl减少，相反当CASK表达抑制时， 与EZA分子免疫共沉淀的Idl明显增多。提示同样作为Idl分子的结合伙伴，CASK与 EZA分子可能存在类似竞争的关系。 通过上述研究，我们提出一个尚未见报道的哺乳动物细胞增殖抑制信号:细胞外(细 胞间质)信号传递到支架蛋白CASK，CASK与细胞内分子Idl结合，减少了Idl与bHLH 类转录因子EZA的结合，由于Idl是EZA负调控因子，，EZA转录因子与Idl结合减 少，相应地对某些下游靶基因的转录活性增强，通过结合p21/P16基因调控序列的 E一box(CANNTG)区，促进pl6、pZI表达增加，抑制细胞周期转换，抑制细胞增殖。
【图文】：

第三军医大学博士学位论文个大的转录因子家族bHLH家族成员的负向调控因子，bHLH家族转录因子参与调控p16、pZI的表达业已在某些哺乳动物细胞中得到证实，而Idl通过负调节bHLH转录因子，抑制p21、pl6基因的表达[20，2l，22]、促进细胞增殖。我们推断可能存在一条尚未被证实的调节ECV304细胞增殖的信号通路(见图l):CASK通过与Idl的结合，间接影响了某种(些)bHLH类转录因子的活性，进而影响了参与细胞增殖或细胞周期调控的效应分子的转录、表达，最终抑制细胞的增殖。

APal和EcoRI酶切线性化过程中，切除的多克隆位点片断中含有Hindlll单酶切位点，而重组阳性质粒失去了Hindnl酶切位点，不能被孤ndm酶切。利用这个特点，可以对阳性重组质粒进行初步鉴定，图1为两个阳性重组质粒siCASK一1和siCASK一2的Hindm酶切电泳结果，可见pBS用6空载体可以被Hindm酶切成线性，电泳呈现单一带型(线性化质粒)，而阳性重组质粒未被线性化。图1、重组siRNA表达质粒的Hindlll酶切鉴定Figure1IdentifieationofreeonstrUetedsiRNAPlaslnidsbyHindflldigestionM:DNA分子量标准;l、PBS/U6;2、siCASK一l;3、siCASK一2.2、psileneer3.IHI一Hygro为载体的siRNA表达质粒的构建psilencer3.IHI一Hygro为Ambinn公司的一种以siRNA表达载体，它主要的特点是含有人HlRNA聚合酶m启动子，并且加入了真核细胞的筛选标记潮霉素抗性基因。^mbion公司提供少量线性化(经BamHI和Hind111双酶切)的psileneer3.IHI一Hy盯。载体无法进行扩增，本研究首先以线性化载体构建了siGFP重组质粒，经过序列比对，该重组质粒仍然含有BamHI和Hindm双酶切位点
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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1 刘煜,赵晓航,吴e

本文编号：2695682