抗人胃泌素单克隆抗体及其单链抗体的研制

发布时间：2020-06-05 04:25

【摘要】：目的:建立能稳定分泌高亲和力、高特异性抗人胃泌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在对其亲和力、特异性以及生物学功能进行鉴定的基础上,克隆抗人胃泌素单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,构建抗人胃泌素单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行初步鉴定。方法:以胃泌素合成肽与钥孔戚血蓝蛋白的偶联物为免疫原,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗人胃泌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,大量制备并经盐析、蛋白G亲和层析获得纯化的单克隆抗体,采用SDS-PAGE对抗体进行分子量和纯度鉴定,间接ELISA法检测效价,双向琼脂扩散实验鉴定类和亚类,非竞争酶免疫实验测定亲和力,斑点ELISA和免疫组化鉴定特异性,并且分别采用荧光染色法和MTT比色法,研究其对胃泌素/胃泌素受体结合的阻断作用,以及对SGC-7901细胞增殖的抑制作用。在此基础上,选择杂交瘤细胞株E8,用TRIZOL试剂提取总RNA,通过RT-PCR,采用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物,扩增抗体可变区基因。通过重叠延伸PCR将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来,构建单链抗体基因,克隆到pGEM-T载体中,通过酶切、PCR和测序进行鉴定。然后用限制性内切酶双酶切pGEM-gastrin-ScFv质粒和pET-28a(+)质粒,构建pET-gastrin-ScFv重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21
【图文】：

图1一1McAb制备的技术路线Figuerl一1PorceduerofrPerParationofmonoclonalantibody.2L2小鼠的免疫和细胞融合选择6周龄的BALB/C小鼠，用胃泌素合成肤一KLH偶联物作为免疫原，加完全福氏佐剂或不完全福氏佐剂，经皮下多点多次免疫小鼠。细胞融合前3天，，腹腔加强免疫一次。取免疫小鼠脾脏制备脾细胞悬液，将脾细胞与SPZ/0骨髓瘤细胞按10:1比例混合，离心洗涤细胞2次。末次离心后尽量吸出上清，轻叩管底使细胞沉淀混匀成糊状，将离心管置37Co水浴中，缓慢加入lml预热的50%PEG4。。。，lmin加完，静置lmin

0.000.50蛋白浓度(mg/ml)图1一2蛋白浓度一28。值标准曲线Figurel一2StnadardeuvreofrtherelationshiPbetweenProteineoneentrationandAZoovalue表1一2Tablel一2三株抗人胃泌素McAb腹水盐析前、后的蛋白浓度TheProteineoneentrationinaseitesofthreestrainsanti一gastrinMeAbbeofreandatferPreeiPitationbymamoniumsulatfe腹水(McAb)盐析前积(ml)盐析后盐析前盐析后A11252846CZ18203813.610.7ES272959.120.1.3L3蛋白C亲和层析纯化抗体蛋白G亲和层析纯化抗体的洗脱峰记录图谱见图1一3。通过间接EusA法，证实2#洗脱样品为
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 方瑾,宋今丹;抗人大肠癌单链抗体基因的克隆与表达[J];癌症;2002年07期

2 金洪涛,金宁一,王宏伟,江文正,王宏;抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化[J];中国生物制品学杂志;2002年06期

本文编号：2697504