【摘要】：内皮素-1(endothelin-1, ET-1)最初由猪主动脉内皮细胞培养液中分离得到的一种活性肽,是目前已知最强的缩血管活物质。除内皮细胞外,还发现角质形成细胞、血管平滑肌细胞、白细胞、心肌细胞及间质细胞及一些肿瘤细胞也发现能分泌ET-1。ET-1通过两种G蛋白耦联的受体(G-protein-coupled receptor, GPCR),ETA和ETB受体发挥作用。ETA受体主要在血管内皮、神经元及肥大细胞发现有表达,而ETB受体主要在角质形成细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞、神经胶质细胞等表达。 辣椒素可引起新鲜分离的背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元细胞内向电流及细胞内游离钙浓度上升,ET-1可通过蛋白激酶C (protein kinaseC,PKC)途径增强DRG神经元细胞内钙对辣椒素的反应,辣椒素引起的内向电流也明显增强。动物局部应用ET-1出现伤害性行为表现,而人局部应用ET-1出现疼痛,近年来发现人及动物局部应用ET-1也出现搔痒。 由同一种物质同时引起疼痛和搔痒,机体如何处理疼痛和搔痒的信息仍不得而知。ET-1引起搔痒的分子机制尚不清楚,脊髓中的胃泌素释放肽受体(Gastrin-releasing peptide receptor, GRPR)是搔痒感受分子,选择性去除小鼠脊髓Ⅰ层表达GRPR的神经元,动物对所有测试的致痒剂(包含ET-1在内)均无反应,提示初级神经元可能释放不同的神经递质,激活脊髓中痛或者痒特异性感受神经元,本文主要研究ET-1引起搔痒分子信号通路。 方法 实验动物 实验选用雄性C57BL/6J小鼠,体重20-25g,由中山大学实验动物中心提供,本研究及实验动物的使用与处理方法得到广东医学科学院动物试验伦理委员会的书面同意,并按照规定遵守动物福利及尽可能减少使用动物的数量。 颈背部注射搔痒模型 小鼠于实验前一天颈背部皮肤剃毛,小鼠于实验前30min放置于透明的塑料盒子里预适应。应用30G针头进行颈背部皮内注射,注射药物后立即放入塑料盒子里面观察,观察小鼠用后肢搔抓注射部位次数,小鼠完成从举起后肢搔抓注射部位到放下后肢全过程为一次搔抓,观察30min。 脸颊部注射行为学观察 实验前一天小鼠脸颊部剃毛,实验前放置于透明的塑料盒子预适应30min,小鼠从盒子里面取出后用微量注射器(将30G针头与微量注射器相连)进行脸颊部皮内注射,注射容量为10μl。注射药物后立即放入塑料笼子里面观察,记录30min内动物分别用前肢拂和后肢搔抓注射部位的次数,用注射侧前肢拂注射部位是疼痛相关的行为学表现,用后肢搔抓注射部位是搔痒相关的行为学表现。 热痛觉阈值 热痛觉阈值测量实验前一天,小鼠在实验台适应1h,测定热痛觉阈值时,用热辐射刺激仪照射小鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至小鼠出现明显逃避的时间,调节光照强度,使注射药物前逃避时间(paw withdraw time,PWT)为(8-12)s。为避免热损伤,光照时间不超过20s。 去TRPV1神经元小鼠制作 雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素(50mg/kg),对照组注射同样容量的溶剂(PBS含10%ethanol与10%Tween-80),动物在SPF动物房里面饲养6周后进行实验。新生期注射辣椒素能够去除表达TRPV1神经元,用角膜刺激实验验证去除TRPV1神经元的效果,用0.01%辣椒素20μl喷到小鼠眼睛上,小鼠会用前肢拂眼睛,记数1min内用前肢拂眼睛的次数,如1min内用前肢拂眼睛的次数少于5次就认为已经成功去除TRPV1神经元。 背根神经节神经元细胞培养 C57BL/6J小鼠用七氟醚麻醉后背部皮肤消毒,剪下脊柱后快速转移至放置于冰上培养皿内,将脊柱泡在冷的L15内,无菌状态下取出DRG,用0.25%胶原酶Ⅳ于37℃水浴振荡1h,机械吹打后用低温离心机在下离心(1000rpm)5min。培养液为含10%胎牛血清的Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM),加入青霉素G钠盐和硫酸链霉素各10μ g/ml,并且加入神经生长因子50ng/ml,细胞接种于多聚左旋赖氨酸包被的玻片或培养板上,置于37℃5%CO2培养箱内培养。 PKCε膜转位 细胞接种于多聚左旋赖氨酸包被的直径为10mm玻片上,用0.01M磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)洗脱培养液后,加入PBS或ET-1后放入37℃及5%CO2培养箱内60s后吸出上清,用4%PFA固定20min,漂洗后使用含10%的山羊血清室温下作用1h,加入第一抗体,分别为兔来源抗PKCε抗体(1：500)及豚鼠来源的抗TRPV1抗体(1：3000),并加入0.2%Triton4℃下孵育16h,漂洗后加入结合有Alexa Fluor594抗兔IgG和结合有Alexa Fluor488抗豚鼠IgG的第二抗体孵育2h。用激光共焦显微镜(Zeiss, Germany)观察PKCs膜转位情况。 细胞内cAMP检测 细胞接种于多聚左旋赖氨酸包被的24孔培养板上,倒去培养液,用PBS冲洗后,加入含磷酸二酯酶抑制3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX,2.5mM)的PBS(含0.1%葡萄糖)在37℃培养箱内孵育10min,吸出培养液,加入含IBMX (2.5mM)及ET-1(10nM)的PBS(对照组只加入IBMX)继续孵育60s,倒去培养液,每孔加入细胞裂解液250μ1(0.1M HC1,0.8%Triton X-100),室温下放置10min,吸出后离心(10000rpm)2min取上清,上清100μl应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测量标本中cAMP水平,采用小鼠cAMP单克隆抗体ELISA检测试剂盒检测。用纯化的山羊抗小鼠抗体IgG包被96孔板,制成固相抗体,在实验前20min准备好所有试剂及酶联板放置于室温,往包被抗体的96孔板中依次加入cAMP标准品或样品、小鼠单克隆cAMP抗体、辣根过氧化物酶(horse-radish peroxidase, HRP)结合的cAMP,经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的cGMP呈正相关。用在450nm波长下测定吸光度(OD值),根据标准品浓度吸光度曲线测量样品浓度。另取上清50μ l应用二喹啉甲酸蛋白质试剂盒(bicinchoninic acid protein assay kit, BCA protein assay kit)测量蛋白含量,测量562nm处吸光度,根据标准品浓度吸光度曲线计算样品蛋白浓度。我们将细胞内cAMP浓度根据蛋白含量进行校正比较,最终细胞内cAMP浓度单位表达为pmol/mg蛋白。 结果 1ET-1通过激活ETA受体引起搔痒 当颈背部皮内注射100μl浓度为10μM(总量为1000pmol)的ET-1时产生明显的搔抓,30min内小鼠用后肢抓注射部位的次数达到360次,依次稀释10倍发现颈背部皮内注射总量为1pmol(此时浓度仅为0.01μM)ET-1仍可引起明显搔抓,当注射总量为100pmol时30min内引起搔抓187次,从ET-1引起搔痒的剂量反应关系可以看到这一剂量(1μM,100μl)引起中等程度的搔抓次数,我们以后的研究中除非特别说明均采用这一剂量的ET-1(1μM,100μl)。 脸颊部注射ET-110μM(容量为10μl)可引起明显后肢搔抓与前肢拂注射部位,注射ET-11μM引起明显后肢搔抓,但前肢拂注射部位不明显,而注射ET-10.1μM不能引起明显的后肢搔抓与前肢拂注射部位。 特异性ETA受体拮抗剂BQ123及特异性ETB受体拮抗剂BQ788单独颈背部皮内注射时并不引起明显的搔抓反应,BQ123100nmol与100pmol ET-1共同注射时可明显抑制ET-1引起的搔抓,而BQ78830nmol与100pmol ET-1共同注射时可明显增加ET-1引起的搔抓,说明ET-1通过ETA受体引起搔痒,而ETB受体可能发挥止痒作用。 2PKC途径介导ET-1引起的搔痒 双吲哚亚酰胺I (Bisindolylmaleimide I, BIM)是蛋白激酶C (protein kinaseC,PKC)抑制剂,BIM2μg或10μg与ET-1共同注射均能明显抑制ET-1引起的搔痒,说明ET-1引起的搔痒和PKC途径有关。培养的DRG神经元用ET-1(10nM)处理后可见PKCε主要分布在细胞膜上,而未用ET-1处理的DRG神经元可见PKCε主要分布在细胞浆内。 巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)是常用的PKC激活剂,颈背部皮内注射PMA1μM和10μM时(总量分别为100pmol与1000pmol)时引起搔痒,而注射10pmol时不引起明显搔痒。 足底注射PMA与ET-1均能引起热痛觉过敏,小鼠足底注射PMA100pmol/10μl一直出现抬足等行为,不能测量热痛觉阈值,10pmol/10μl引起明显的热痛觉过敏,1pmol/10μl引起的热痛觉过敏ET-1100pmol/10μl所引起的热痛觉过敏相当,足底注射1μg BIM15min后可以完全抑制同一部位注射ET-1和PMA引起的热痛觉过敏。 3cAMP-PKC途径介导ET-1引起的搔痒 由磷酯酶C (phospholipase C, PLC)激活PKC是PKC激活的经典通路,我们应用PLC阻滞剂U73122观察PLC通路的作用。颈背部注射U73122(10pmol,100μl)不引起明显搔抓及其他异常表现,但与预期结果相反,U73122(100pmol)与ET-1共同注射明显增加ET-1引起的搔抓次数。提示可能由非经典通路环单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)激活PKC从而介导ET-1引起的搔痒。 ET-1(10nM)刺激培养的DRG神经元60s后,应用cAMP单克隆抗体ELISA法测量细胞内cAMP浓度的变化,ET-1处理神经元后明显增加细胞内cAMP浓度。直接应用腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase, AC)抑制剂SQ22536对ET-1引起搔痒的作用。SQ22536与ET-1共同注射可剂量依赖性地抑制ET-1引起的搔痒。AC激活后引起细胞内cAMP浓度升高,cAMP浓度升高引起蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)激活,PKA阻滞剂H89与ET-1共同皮内注射对ET-1引起的搔痒无明显作用。 为了排除U73122的非特异性作用,我们研究了更高浓度的U73122对ET-1及复合物48/80(compound48/80, C48/80)引起搔痒的影响。C48/80可刺激培养的肥大细胞脱颗粒释放组胺,U73122(10μM)可明显抑制肥大细胞的脱颗粒。C48/80皮内注射可引起明显的搔痒,与U73122(1000pmol)共同注射后引起的搔痒可明显减轻,而U73122(1000pmol)仍然增加ET-1引起的搔痒。皮内注射phosphatidylcholine specific phospholipase C(磷脂酰胆碱磷酯酶C, PC-PLC)抑制剂D609,15min再在同一部位注射ET-1或者C48/80,D609可抑制ET-1引起的搔痒,而D对C48/80引起的搔痒无明显影响。 4TRPV1、H1R、TRP、TRPA1在ET-1引起搔痒中的作用 腹腔注射TRPV1拮抗剂辣椒平(4mg/kg)或者H1R拮抗剂美吡拉敏(mepyramine,40mg/kg)对ET-1引起的搔痒无明显影响。新生期注射辣椒素后能去除TRPV1神经元,ET-1在新生期注射辣椒素成年动物不引起明显搔痒,而对照组成年动物对ET-1引起的搔痒反应无明显影响。非选择性TRP抑制剂钌红(ruthenium red, RR,5nmol)共同注射可增加ET-1引起的搔痒,但同样剂量的RR抑制组胺引起的搔痒。TRPA1拮抗剂AP18(100nmol)共同注射可增加ET-1引起的搔痒,同样剂量的AP18对组胺引起的搔痒无明显作用。ET-1引起的疼痛可能与TRPA1有关,RR与AP18增加ET-1引起的搔痒可能与其减少疼痛有关。在皮内注射ET-1前15min皮下注射吗啡(5mg/kg),吗啡对ET-1引起的搔痒无明显影响,提示ET-1引起的搔痒与疼痛无关。 5ETB受体的止痒作用 皮下注射纳洛酮0.5mg/kg可明显抑制15min后皮内注射ET-1所引起的搔痒,而小剂量的纳洛酮(2nmol)皮下注射对ET-1引起的搔痒无明显影响,当纳洛酮与ET-1共同一起皮内注射时,两种剂量的纳洛酮(2nmol与0.5mg/kg)均明显增加ET-1引起的搔痒,这种作用与纳洛酮的全身作用无关,因为全身应用纳洛酮的效果与此相反或者在小剂量的时候无明显效果。 外周存在μ、κ、δ三种阿片类受体亚型,我们应用选择性亚型拮抗剂来观察各亚型的作用,大剂量KOR拮抗剂Nor-BNI(超过15nmol/50μl时)颈背部皮内注射时可引起搔痒,而5nmol/50μl时不引起明显搔痒,我们选择了这一剂量进行研究,其他的剂量参考以前的研究,MOR拮抗剂CTOP或DOR拮抗剂naltrindole一起注射对ET-1引起的搔痒无明显影响,而Nor-BNI明显增加ET-1引起的搔痒,可见外周KOR介导了ETB受体的止痒作用。 KOR激动剂的抗伤害作用与一氧化氮有关,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase)有内皮型(endothelia)、神经型(neuronal)和诱导型(inducible)三种亚型,nNOS抑抑剂可拮抗KOR激动剂的止痛作用。应用非选择性NOS抑制剂发现L-NAME(200nmol)明显增加ET-1引起的搔痒,而D-NAME对ET-1引起的搔痒无明显影响。NOS有三种亚型分别为内皮型、神经型、诱导型,应用特异的选择性亚型抑制剂与ET-1共同注射,eNOS抑制剂(L-NIO,200nmol)可明显增加ET-1引起的搔痒,而诱导型iNOS抑制剂(AMT,5nmol)、神经型nNOS亚型抑制剂(Nco-Propyl-L-arginine,20nmol)对ET-1引起的搔痒无明显作用。由于神经元中主要存在nNOS,角质形成细胞中主要存在eNOS, eNOS抑制剂也能增加ET-1引起的搔痒说明KOR激动剂可能通过角质形成细胞起作用。 结论 1ET-1通过ETA/AC/PKC途径引起搔痒。 2由cAMP激活PKC是非经典途径,这个通路通过Epac(exchange proteins activated directly by cyclic AMP, cAMP直接激活的交换蛋白)激活下游PLC与PLD,在体内与体外实验均发现从cAMP激活PKC离不开PLC与PLD的作用,本研究中PLC抑制剂U73122与预期相反的作用,说明ET-1引起搔痒的cAMP激活PKC通路与以前发现的通路不同,我们发现了一个全新的由cAMP激活PKC通路,该通路可能与PC-PLC通路有关。 3ETB受体发挥止痒作用,外周阿片类受体κ亚型通过eNOS介导这一止痒作用,角质形成细胞释放的NO也可能发挥止痒作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
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