利用胚胎干细胞小体研究GATA-6通过上调骨形成蛋白-2对胚胎发育早期凋亡的抑制作用

发布时间：2020-06-06 09:52

【摘要】：凋亡对于胚胎发育具有至关重要的作用，细胞增殖和凋亡的共同作用才雕塑出了面部复杂精细的结构。各种原因导致的凋亡改变，会干扰两侧腭突和原始腭的融合，从而引起腭裂的发生。研究证明骨形成蛋白（bone morphogenetic protein (BMP))通过调节凋亡，能够导致上颌骨和腭骨的缺损，进而引起腭裂的发生；而其上游基因GATA-6作为与胚胎发育密切相关的转录调节因子，能引起多个胚层来源的器官发育异常。GATA-6等位基因完全被敲除的杂合子动物无法存活，而胚胎干细胞小体（embryonic stem cell derived embryoid bodies (EBs))能够准确模拟胚胎发育早期的情况，因此是研究GATA-6与腭裂等胚胎发育异常导致的先天性畸形相关性的理想模型。 GATA蛋白家族，作为一组锌指翻译因子，对于细胞分化和胚胎器官发育具有非常重要的作用。在小鼠体内敲除GATA-6会阻碍内胚层的分化，并且引起外胚层的凋亡。之前的实验观察到，敲除GATA-6的EB内出现大量的凋亡，并且其内胚层的分化会受到影响。本实验发现，将正常的内胚层细胞的移植到突变的胚胎干细胞小体能够完全阻止细胞凋亡，并恢复外胚层极化和成腔。laminin能够诱导基底膜细胞在突变胚胎干细胞小体上组装；而laminin γ1被敲除的内胚层细胞移植到突变胚胎干细胞小体上，由于不分泌三聚体层粘连蛋白，就不会形成基底膜，只能部分抑制凋亡。这些现象说明内胚层细胞来源的基底膜和非基底膜因素都对于GATA-6依赖的细胞存活具有重要的作用。我们的微阵列分析显示在EB分化的过程中，BMP-2、IGF-2、TGF-β和VEGF-A的表达增加，而BMP-4，FGF-4，PDGF-A，PDGF-C和VEGF-C的表达减少。为了确定这些生长因子的表达在GATA-6被敲除的胚胎干细胞内是否发生了改变，我们采用了逆转录PCR（RT-PCR）和免疫印迹的方法对2天的EB进行分析，发现GATA-6被敲除后，BMP-4和IGF-2的mRNA表达明显减少，而FGF-4的mRNA表达不变。重要的是，BMP-2的mRNA在2天正常的EB内已经能检测到，然而在GATA-6被敲除的EB内则检测不到。为了证明各种生长因子对EB凋亡的影响，我们在1天的GATA-6-/-的EB内，使用分别使用浓度为0.1μg/ml的BMP-2, FGF-4, EGF, IGF-2,PDGF和TGF-β1分别作用24小时，并且与对照组相比，然后使用全量免疫染色，通过检测cleaved caspase-3对凋亡进行分析。结果显示凋亡广泛的出现在GATA-6-/-的EB的周围细胞内，而BMP-2的加入明显抑制了caspase-3的激活， FGF-4, EGF和PDGF则没有效果。将BMP-2的浓度增加到0.25μg/ml后，凋亡进一步减少。使用IGF-2作用于突变的胚胎干细胞能够轻微的减少caspase-3的活性，而TGF-β则表现出相反的作用。免疫印迹分析证明，外源性的BMP-2能够明显降低GATA-6被敲除的胚胎干细胞小体内的凋亡，而IGF-2的作用比较弱。进而我们通过染色质免疫共沉淀实验（Chip）证明GATA-6与BMP-2的启动子直接连接，GATA-6被敲除后BMP-2在转录和蛋白水平表达均减少。另外，在正常的胚胎干细胞小体内过量表达BMP的拮抗剂noggin或者抑制BMP的受体BMPR1b， EB的内胚层的形成会受到抑制，凋亡也会明显增加。 GATA-6被敲除的EB内，SMAD1/5磷酸化明显减少。SMAD（drosophila mothers against decapentaplegic protein）磷酸化的减少能够被外源性BMP-2逆转。用R-SMAD抑制剂DMH1作用于GATA-6被敲除的EB，能够诱导内胚层和外胚层的细胞发生凋亡。为了进一步确定SMAD途径的激活是否提供了一个存活信号，我们将1天的正常EB与5μM的Akt1/2抑制剂, MAPK kinase1/2抑制剂U0126,p38抑制剂SB203580和R-SMAD磷酸化抑制剂DMH1共同培养了24小时，在这些抑制剂中，通过检测caspase-3的活性，发现只有DMH1明显引起了凋亡而MAP激酶和Akt的抑制剂则起不到这样的作用。这些结果表明，BMP信号通过典型Smad通路促进胚胎上皮细胞的存活，进而影响组织形态发生。总之，，GATA-6能够通过调节内胚层分泌BMP-2和基底膜成分在胚胎早期发育过程中抑制凋亡，从而促进细胞存活，并通过SMAD1/5磷酸化这一途径发挥作用。基底膜反过来可以诱导外胚层分化和成腔。GATA-6直接与BMP-2的启动子连接以激活BMP-2，BMP-2与基底膜的作用一致，保护外胚层避免凋亡，并且以自分泌的方式促进内胚层的分化。这一发现对于进一步了解GATA-6、BMP-2调节的凋亡与腭裂等胚胎发育异常导致的畸形发生的相关性，探讨这些畸形发生的机制，并探索其治疗的新方法具有重要的意义。
【图文】：

基因芯片技术,内胚层,通风橱,柱状上皮

去离子水定容至 100ml。配制时，在通风橱内进行。2.3 实验结果2.3.1 GATA-6 通过影响内胚层和基底膜的形成调节 EB 内亡。对于第 2 天，第 3 天和第 5 天的 EB 的 GATA 翻译因子析表明，GATA-4 和 GATA-6 在第 3 天，也就是内胚层开始面形成时，表达明显增加，并且于第 5 天，也就是 EB 发育囊腔（即内胚层和柱状上皮层（CEE）时进一步增长（见图

细胞核,基底膜

也无法形成其下方的基底膜（见图2.2、图 2.3）。图 2.2：免疫荧光显微镜显示， GATA- 6 在正常的内胚层细胞的细胞核表达。而 GATA6 - / - 的 EB 作为阴性对照。使用Rhodamine-phalloidin 对 F-actin 进行染色，显示在 5 天的正常 EB 中，actin 带已形成，而 Gata6-/-的 EB 则没有形成 actin 带。Figure2.2 ： Immunofluorescence microscopy showed that GATA-6 wasexpressed in the nucleus of normal endodermal cells. Gata6-/- EBs were usedas negative controls. Rhodamine-phalloidin was used to stain F-actin to showthe formation of an actin belt in 5-day normal EBs but not Gata6-/- EBs.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321

【参考文献】