模拟脑内移植环境追踪间充质干细胞移植功能重建体外实验研究

发布时间：2020-06-06 10:17

【摘要】：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其具备自我更新、无限增殖、多向分化潜能等优越性,成为神经医学基础实验研究关注的热点,为疾病的临床治疗带来新的希望。在中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病中,缺血性脑卒中、颅脑外伤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓损伤等给家庭与社会带来沉重的负担。目前为止,尚缺少特别理想的治疗方法,因此,寻找新的治疗策略势在必行。间充质干细胞在再生医学中的作用已基本得到学术界的认可。由间充质干细胞分化来的神经干细胞(neural stem cells, NSCs)在修复CNS功能损害中的作用亦受到广泛关注,并取得一定乐观结果。然而,这些移植的间充质干细胞是通过何种途径、何种机理而完成修复作用,尚无确切定论。目前为止,有分化细胞替代假说、营养因子假说、免疫调控假说、抗炎假说、以及结构整合假说等。本研究以间充质干细胞移植修复颅脑损伤为研究目标,以结构整合机制为探索重点,在体外模拟脑内微环境、通过“间充质干细胞-皮层神经元共培养体系”的实验分析,探讨了可能存在的二者结构整合及条件,为干细胞再生医学理论提供新的数据。间充质干细胞来源丰富,包括骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞、脐带干细胞、脐血干细胞、胎盘干细胞、胚胎干细胞,多能诱导干细胞等。其中,骨髓源间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)与脂肪源间充质干细胞(adipose derived mensenchymal stem cells, ADSCs)具有可自体移植,无免疫排斥以及不涉及伦理道德等特点在治疗研究中应用较多,但二者又各有所长,前者具有较强的免疫调节能力,后者具备增殖速率快与克隆形成率高的特点,本研究在第一、二章节中选用增殖速率快与克隆形成率高的ADSCs,在第三章选用有较强的免疫调节能力的BMSCs为实验对象。无论采用哪种干细胞移植进行CNS损伤修复研究,都将涉及移植干细胞在中枢神经组织功能重建问题,这种功能重建很大程度上受移植细胞所处微环境(microenvironmrnt)的影响,就干细胞移植修复脑损伤而言,干细胞脑内移植后定植的微环境主要包括脑内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及脑内细胞间相互作用(cell-cell interaction)。微环境细胞外基质成分中的各种可溶性因子(soluble factors)、蛋白等复杂成分作用于干细胞维持并调控着干细胞存活、诱导、分化、分泌、免疫调节等,使干细胞发挥相关修复功能；同时,干细胞与宿主的颅内细胞(如神经元等)之间发生复杂的相互作用、相互影响,在一定程度上以细胞间结构为基础参与受损脑组织修复。近年研究表明,脑内微环境细胞外基质成分在干细胞发生发育、诱导分化过程中发挥有重要作用。其中表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)、刺猬因子(Sonic Hedgehog, Shh)等,在保证细胞外基质各组分浓度平衡而维持干细胞正常形态与功能；转化生长因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)等则以正负反馈方式,通过信号通路来调节神经发育中的分化过程；同时,细胞外基质中的胶原蛋白(collagen)、层粘连蛋白(laminins)、纤维连接蛋白(fibronectins)等成分在控制干细胞再生、分化方面也起到一定作用。移植入脑内的干细胞与宿主细胞之间的相互作用是通过干细胞表面表达在脂质双分子层表面的信号分子而实现。初步发现,干细胞本身的极性是干细胞分裂增殖的机制之一；干细胞膜上的受体改变能够激活下游通路的靶点,从而调节细胞功能(如细胞的粘附整合、变形及神经突触的可塑性等)。在干细胞移植过程中,为了研究间充质干细胞与宿主细胞间的相互作用,往往需要对待移植间充质干细胞进行细胞标记,以便于很好地鉴别和示踪发挥主要作用的神经干细胞,并能够区别供体细胞与宿主细胞、以精确观察到干细胞的生存,分化,迁移及与其他细胞组织结构整合的情况。常用的细胞标记物主要包括物理标记物(如：氧化铁颗粒类、锰离子、包裹荧光染料的硅纳米颗粒等)、化学标记物(如：Hoechst, DiI, PKH2/PKH3/PKH26,异硫氰酸荧光素／四甲基若丹明异硫氰酸荧光素,羟基荧光素、放射性核素等)和生物标记物(如：核酸标记物、绿色荧光蛋白、抗体显像标记物、受体显像标记物等)。众多的细胞标记物中,究竟哪一种标记物能够特异性地标记移植细胞,也是研究过程中易忽略的问题。不恰当标记物的选择,将对干细胞标记后体外实验或体内移植研究造成干扰,而既往移植实验过程中的细胞标记未能引起重视,由此,本研究也关注了细胞标记物的选择和使用。基于干细胞的多种特性、干细胞在移植后与宿主间微环境之间复杂的发育分化整合作用、标记物对干细胞标记的特异性以及干细胞与宿主皮层神经元间的相互作用,本研究进行了一系列研究。首先,提取大鼠大脑海马组织的细胞外基质成分模拟大鼠脑内微环境,以细胞外基质成分的不同浓度梯度为检测实验条件,通过免疫荧光、Western Blot、QT-PCR等技术鉴定脂肪间充质干细胞在相应浓度的细胞外基质发育分化,以神经球数量及维持时间为评估指标确定细胞外基质对脂肪间充质干细胞作用的最适浓度；然后,选择当今广泛使用的PKH26染料对脂肪间充质干细胞进行标记,又以低渗法裂解PKH26染料标记好的干细胞,模拟干细胞移植后大部分细胞死亡过程,再将PKH26标记后的细胞碎片与细胞共培养构建体外移植模型,并同时通过鼠尾静脉将裂解的细胞碎片移植入大鼠体内,以荧光显微技术追踪体外实验、体内实验的细胞或各脏器组织(如肝、脾、脑、肾、外周血等)被PKH26染料影响情况；最后,通过模拟骨髓间充质干细胞脑内移植模型,体外建立骨髓间充质干细胞与皮层神经元的共培养体系,在超微结构水平探索皮层神经元轴突在骨髓间充质干细胞作用下的迁移趋势,探讨骨髓间充质干细胞参与突触可塑性的能力,为完善间充质干细胞修复CNS疾病机制提供数据参考。第一章模拟脑内微环境追踪间充质干细胞发育分化实验研究目的：探索间充质干细胞于大鼠海马结构细胞外基质成分中的发育分化情况,及其分化后与脑内皮层神经元的相互作用。方法：解剖分离300g的Wistar近交系大鼠大脑海马组织,置于DMEM/12培养基,低温(4℃)摇床振荡2h,高速离心(18000×g)后获取海马结构的细胞外基质。获取出生3天的Wistar近交系大鼠的皮下脂肪组织,使用0.3%I型胶原酶消化脂肪组织,获取ADSCs,并对其形态学观察、免疫表型鉴定及染色体检测；将ADSCs分别置于含海马组织细胞外基质终浓度分别为0(对照组)、50、100、200、400μl/ml的无血清DMEM/F12培养基中培养,观察6天,通过免疫荧光、激光共聚焦技术、Western Blot技术比较各组细胞Nestin. CD133的表达情况；QT-PCT检测各组细胞Nestin、CD133的基因表达情况,同时比较各组中细胞成球个数,以探索ADSCs发育、诱导的最适脑内微环境；进一步于最适海马组织细胞外基质终浓度中分化神经球,对分化细胞行β-tubullin Ⅲ、 MAP2. GFAP、S100及p75NGFR免疫荧光检测,并将分化细胞与皮层神经元建立共培养体系,通过检测原代皮层神经元轴突长度及突起数量来探索分化细胞对皮层神经元的作用。结果：大鼠ADSCs在含胎牛血清浓度为10%的DMEM/F12中呈贴壁生长,梭形,长出突起；经流式细胞仪检测,其表达CD29、CD90阳性,CD45及同型对照FITC阴性；经传代至第三代ADSCs的染色体检测未见异常；ADSCs于细胞外基质终浓度为50、100、200、400μl/ml的无血清DMEM/F12中培养第二天出现细胞球,对照组(0μl/ml)中无细胞球形成(与200μl/ml组比较,P,=0.000),余各实验组细胞球数量无差别(P2=0.626, P3=0.143, P4=0.979,均0.05),200μl/m实验组与对照组比较具有显著差异(P1=0.0000.05)；至第6天,在200μl/ml组中的细胞球数量明显多于0、50、100、400μl/ml组(P1’=P2’=P3’=P4’=0.000)。在免疫荧光及激光共聚焦检测中,200μl/ml组中细胞球表达Nestin、CD133阳性,Western Blot检测其中Nestin、CD133蛋白明显高于对照组,QT-PCR检测Nestin、 CD133的基因分别是对照组中的148(F=10.746,P=0.0310.05)、220倍(F=172.500,P=0.0000.05)。进一步分化的细胞球变成贴壁生长单细胞状态、呈长梭形,并伸出突起,免疫荧光检测分化的细胞表达GFAP、S100、p75NGFR阳性,但不表达β-tubullin Ⅲ、 MAP2蛋白；与分化细胞共培养的皮层神经元轴突长度(123.62±11.991μm)明显比单纯皮层神经元轴突(73.00±7.41μm)长(P=0.0000.05)。结论：大鼠ADSCs在终浓度为200μ1/ml的海马细胞外基质中可发育诱导为表达Nestin、CD133阳性的神经干细胞；神经干细胞在同样浓度下的细胞外基质中,可进一步分化为表达GFAP、S100、p75NGFR阳性的胶质样细胞；胶质样细胞可促进皮层神经元轴突生长。第二章细胞标记物PKH26非特异性实验研究目的：探索细胞标记物PKH26标记间充质干细胞的非特异性,为避免不恰当选用标记物带来实验干扰提供依据。方法：获取出生3天的Wistar近交系大鼠皮下脂肪组织,使用0.3%I型胶原酶消化脂肪组织,获取ADSCs,并对其形态学观察,使用细胞标记物PKH26标记ADSCs,经CCK-8、Alamar Blue检测PKH26对ADSCs增殖及毒性的影响；利用无菌低渗蒸馏水裂解PKH26标记的ADSCs(未标记的ADSCs为对照组),收集并证实为已裂解的细胞碎片,作为模拟间充质干细胞移植过程中正常死亡的细胞,通过将细胞碎片与间充质干细胞共培养、以及将细胞碎片通过鼠尾静脉注射入Wistar近交系大鼠(n=5)体内观察7天,利用荧光显微镜技术检测体外共培养的ADSCs及动物体内肝脏、脾脏、肾脏、脑的冰冻切片以及外周血涂片发射红色荧光情况。结果：大鼠ADSCs在培养环境中呈贴壁生长,梭形,长出突起；刚接种的PKH26标记的ADSCs在荧光显微镜下呈红色球形悬浮于培养环境中。CCK8、 Alamar Blue实验证实,PKH26对ADSCs的细胞增殖(P=0.3440.05)及毒性(P=0.3520.05)没有影响。无菌低渗蒸馏水裂解PKH26标记的ADSCs呈不规则红色絮状,未见红色球形细胞。PKH26标记的ADSCs碎片与未标记的ADSCs共培养后,在荧光显微镜下检测到未标记的ADSCs发射红光；PKH26标记的ADSCs碎片注入大鼠体内,收集的肝脏、脾脏、肾脏、脑的冰冻切片及外周血涂片亦有红光发射,对照组均未检测到红色荧光。结论：PKH26标记的ADSCs在体外、体内移植模型中,可非特异性转移到其他体外细胞或者体内宿主细胞。第三章间充质干细胞与皮层神经元共培养体系中轴突定向迁移、生长及二者间结构整合实验研究目的：建立间充质干细胞移植的体外模型,追踪移植细胞与宿主皮层神经元之间的结构整合,探索间充质干细胞对宿主神经元的定向迁移能力。方法：获取Wistar近交系大鼠骨髓,通过采用全骨髓培养法并利用差速贴壁法纯化获取BMSCs在含10%胎牛血清的DMEM/F12中贴壁生长。对其细胞形态、免疫表型鉴定。分离出生3天内的Wistar近交系乳鼠脑组织皮层,1.5%木瓜蛋白酶消化20min,获取皮层神经元,通过免疫荧光技术鉴定其β-tubullin Ⅲ、MAP2蛋白的阳性表达情况。模拟BMSCs颅内移植模型,将第二代BMSCs接种到培养2天的皮层神经元中建立体外共培养体系(等量细胞数量的单纯BMSCs与单纯皮层神经元为对照组)继续培养7天,以突触(或类突触)结构形成为主要追踪观察指标,使用倒置相差显微镜、免疫荧光技术、原子力显微镜技术、扫描电镜追踪两种细胞间的结构整合,并探索两种细胞间的相互作用。结果：贴壁细胞呈梭形,长出突起。流式细胞仪鉴定其CD29、CD90表达阳性,CD34、同型对照均为阴性。皮层神经元在含2%B-27的无血清DMEM/F12中贴壁生长,胞体透亮,培养2天,开始长出短突起；至第6天,突起延长,免疫荧光鉴定表达β-tubullin Ⅲ、MAP2蛋白阳性。共培养体系中,形态学可观察到皮层神经元轴突具有定向朝向BMSCs迁移生长或者沿着BMSCs表面定向生长的趋势,在原子力显微镜及电子显微镜下可追踪到皮层神经元与BMSCs之间形成突触样结构。透射电镜检测到共培养体系中的BMSCs与皮层神经元的细胞器明显较单纯BMSCs组与单纯皮层神经元组发达；且扫描电镜扫描证实共培养体系中BMSCs表面突起数量远远比单纯BMSCs组中的突起多。且通过计算可证实共培养体系中皮层神经元轴突长度(150.75±48.78μm)明显长于单纯皮层神经元中轴突长度(70.04±20.82μm,P=0.0000.05),但共培养体系中突起个数(2.38±0.58)与单纯皮层神经元突起个数(2.52±0.56)比较无明显差别(P=0.1660.05)。结论：BMSCs与皮层神经元建立体外移植模型共培养体系后,神经元轴突朝BMSCs定向迁移或者沿着BMSCs表面生长；BMSCs与皮层神经元之间可形成突触样结构,共培养体系中两种细胞呈相互促进互为双赢生存状态。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

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