肾小管上皮细胞在CCL20招募Th17过程中的作用

发布时间：2020-06-07 06:36

【摘要】：背景 Thl7作为新发现的一类辅助性T细胞亚群,不仅作用于清除胞外病原体,而且参与自身免疫及炎性疾病,其效应主要通过产生IL-17实现。Th17高表达趋化因子受体CCR6,与其唯一的高特异性配体CCL20趋化因子成对,介导了Th17的募集。研究发现,肾脏组织中CCL20主要由肾小管间质的浸润细胞以及肾小管上皮细胞产生。此外有文献报道IL-17可刺激气道上皮细胞产生CCL20。因此,本研究推测：IL-17作为一种炎症介质可能刺激肾小管上皮细胞产生趋化因子CCL20,从而提示肾小管上皮细胞除履行自身非免疫细胞功能外,在炎症状态下尚具备招募Th17的潜能。 目的 本研究拟探讨IL-17作为一种炎症介质是否可以刺激肾小管上皮细胞产生趋化因子CCL20。 方法 1.细胞培养 用完全培养基(10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的1:1DMEM/F12培养液)常规培养人肾小管上皮细胞(HK-2)。 2.免疫细胞化学 HK-2爬片经处理后以特异性一抗(E-cad,CK-18)孵育,对照组使用PBS代替一抗,后经二抗作用,DAB显色。 3.IL-17处理 随机分组,用梯度浓度(0,1,10,100ng/mL)的IL-17刺激HK-2,以研究剂量效应关系,分别于24h收样行RT-PCR检测,48h收样行ELISA检测；随机分组,以10ng/mL IL-17刺激HK-2于不同时间(6,12,24,48h)终止处理,以研究时间效应关系。 4. RT-PCR分析 用TRIzol法提取总RNA,逆转录为cDNA后进行分析。mRNA相对表达量通过2-△△C表示。每组实验均至少重复3次。 5.ELISA检测 用ELISA检测CCL20的分泌,得到OD值代入标准曲线回归方程以计算CCL20浓度。每组实验均至少重复3次。 6.统计分析 所有数据以均数±标准差表示,采用SPSS17.0统计分析软件进行数据处理。经正态性和方差齐性检验后,采用单因素／ANOVA用于判定显著性差异,P0.05被认为有统计学意义。 结果 1.与对照组相比,E-cad和CK18在HK-2细胞中表达阳性。 2.与对照组相比,IL-17显著促进CCL20的mRNA表达和蛋白分泌(P0.05),并且呈剂量和时间依赖性。 结论 IL-17作为一种炎症介质可刺激肾小管上皮细胞产生趋化因子CCL20,从而提示肾小管上皮细胞除履行自身非免疫细胞功能外,在炎症状态下尚具备招募Thl7的潜能。
【图文】：

根据IL-17处理的剂量效应和时间效应的实验设计以及预实验结果，分组如下。见图2-1。Dose-depentdent / \ Time-depentdenteffects l||PW|^s^ effects. S —、V——Gene level Protein level图2-1实验设计方案1. IL-17剌激CCL20剂量-效应关系对照组（含血清DMEM/F12培基）1 ng/mL IL-17 组（含血清 DMEM/F12 培基+IL-171 ng/mL)1 Ong/mL IL-17 组（含血清 DMEM/F 12 培基+IL-171 Ong/mL)11

士学位论文 第二章趋化因子CCL20在IL-17刺激HK-2细胞时的表达变化1.2.4.4.结果分析选取GAPDH为内参，将所得目的基因的CT值与内参进行比较得出ACT，与对照组比较得出AACT值，用2-AACT法进行计算得出RQ值，即目的基因相对表达量，，每组实验均至少重复3次。其中扩增曲线见图2-2。Amplification Plot
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392.12

【参考文献】

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1 董光富,叶任高,史伟,刘双信,汪涛,阳晓,杨念生,余学清;IL-17 induces autoantibody overproduction and peripheral blood mononuclear cell overexpression of IL-6 in lupus nephritis patients[J];Chinese Medical Journal;2003年04期

本文编号：2701008