兔输卵管蛋白的定位、功能分析及其人同源蛋白基因的克

发布时间：2020-06-07 10:51

【摘要】： 早胚发育促进因子-1(Development Promoting Factor-l，DPF-1，一种兔输卵管蛋白)基因(GenBank 登录号：AF347052)由本实验室先前从兔输卵管粘膜上皮细胞cDNA文库中筛选获得。DPF-1与其他物种的输卵管糖蛋白具有相当高的同源性，尤其是靠氨基端约400 aa．序列非常保守，同源性高达80％左右，并均含有一个几丁质酶结构域，但不具几丁质酶活性。DPF-1的等电点为7.2-8.1。利用谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)融合表达系统，分别表达、纯化了全长DPF-1(GST-DPF-1)、氨基端DPF-1(GST-NTP-DPF-1，不包括信号肽，14-380 aa．)和羧基端DPF-1(GST-CTP-DPF-1，381-454 aa．)，并制备了相应的抗血清；体外实验初步表明，抗CTP-DPF-1抗体能阻断培养于兔输卵管条件培液中的小鼠早胚发育。本课题在上述实验基础上，对输卵管表达的DPF-1进行了定位，并就DPF-1的早胚发育促进功能进行了分析；体外表达DPF-1并观察其在卵母细胞上的分布；克隆人输卵管蛋白基因并进行了体外表达分析。 输卵管蛋白的表达受卵巢激素的控制，主要在排卵前期大量表达。取发情期兔输卵管进行免疫组化分析，结果表明兔DPF-1表达于输卵管壶腹部和峡部的粘膜上皮细胞，且峡部表达量较高。Western Blotting表明，抗GST-CTP-DPF-1抗体能识别小鼠输卵管表达的约50 KD蛋白；用抗GST-CTP-DPF-1抗体进行免疫组化分析，在小鼠输卵管伞部和峡部粘膜上皮细胞显示阳性反应。 添加GST-CTP-DPF-1于M16培液中，可以显著提高受精卵发育至囊胚的比率。抗GST-CTP-DPF-1的抗血清对取自输卵管内的小鼠受精卵的进一步发育具有抑制作用。“中和”实验表明，GST-CTP-DPF-1可以消除其抗血清对小鼠受精卵发育的抑制作用。间接免疫荧光显示，培养于兔输卵管上皮细胞条件培液中的早胚细胞质膜表面大量结合兔输卵管蛋白。这可能暗示，DPF-1促进早胚发育的机制是通过直接与胚胎结合而发挥作用。 为进一步明确兔DPF-1在卵母细胞／早胚中的分布，将兔输卵管蛋白(DPF-1)基因连结于绿色荧光蛋白(EGFP)基因的5’端，构建了真核表达重组质粒(pEGFP-N1／DPF-1)，转染HeLa细胞，获得稳定表达分泌融合蛋白EGFP-DPF-1的HeLa细胞株。该融合蛋白的表观分子量达120 KD，提示表达的蛋白经翻译后修饰。取兔卵母细胞-卵丘细胞复合物(COC)、去除卵丘细胞后的卵或输卵管内的卵母细胞，与该株细胞共培养或培养于该株细胞条件培液中，观察到兔输卵管蛋白在兔卵母细胞上的分布实况。结果显示DPF-1大量结合于卵 摘 要（ABSTRACT） ＠ 一 ！：I纠1胞透明带，先结合于透明带内层，然后纠叫寺在内层多外层少的分令状态上； h。如母细胞质映表面则与＞点状均匀分布。＊＊卜1在卵卅纠厂见上的分小不受其周日前 W！村纠＊包的m【什1，l十颗粒细胞＿广未见有DP卜1 纤3合的痕迹。首次在体外揭示真 性纠］J］以往达分泌的输卵社‘蛋！引能与印母细胞纤i合，并直接观察到共j合的动态过 程。为进一步深入分析输卵管蛋白的功能提供了线索。 为了能通过比较分析揭示输卵管蛋白的通性和作用机制，我们以 ［a一犯PNCTP标记兔DPF1全长cDNA序列为探针，从本实验室所构建的人输卵 管粘膜上皮细胞 cDNA文库筛选人输卵管蛋白基因，获得 2条编码区相差匕 AA 的人输卵管蛋白全长cDNA序列。编码区较长的序列Q265 hp）所演绎的氨基 酸在校基端多出一个串联重复序列：较短的全长序列问262如人是目前所克隆 的最完整的人输卵管蛋白基因，在GenBank的登录号为AY189737。同时获得一 ．。、＿…。。，＿．．t－＿。＿＾，＿＿。…．．＿＿。＿，＿。。、．＿＿．＿＿。＿．。，、．L．＿＿ 条 0．6 kb的短）宇列，与全长）字列和比存在差异剪接。对 AY189737基因进行了 J本列分析，演绎的氨基酸序列一级结构、二级结构分析，预测演绎的氨基酸的等 iii点及理论分子量，，翻译后修饰及修饰位点。 将AYI 89737基因f．G入PE（｝FP－NI 真核表达载体，构建表达人输卵管蛋白 （hoviductin）一绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒 pEGFP－NI／hoviductin，转染 fleLa细胞。借助荧光分光光度计估量条件培液中的EGFP－hoviductin。细胞条件 培液中的荧光蛋白融合的人输卵管蛋白能结合到去透明带的大鼠裸卵质膜外表 面。 对人输卵管蛋白和小鼠输卵管蛋白进行了同源性比较，将人输卵管蛋白分 为高保守区、中等保守区和非保守区，并据此构建了高保守区和中等保守区的温 ＠度诱导原核表达载体。上述的研究工作，均为进一步深入分析包括兔和人输卵管 蛋白在内的通性和作用机制奠定基础。
【图文】：

BlueseriPtllSK/1.9kbDpF一1经NotEcoRI酶切后的产物经1%琼脂糖电泳分析。道一:1kbLadder;道2一4:重组质粒酶切产物。图21%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增的DPF一l编片段。泳道z:1kbLadder，泳道2、3:PCR扩增产AgaroseeleetroPhoresisanalysisofdigestedPBlueseriPtll/1.9kbDPF一1Notl/EeoR1.el，1kbladder;eZ一4，ThereeombinantPlasmidestedbyEeoRI/BamH1.Fig.21%AgaroseeleetroPhoranalysisoftheDfragmenteodingDPamPlifiedbyPCR.Linel，1kbLadder;LineZ&3，TheProduets.P一NI瓜PF一1的构建EGFp一1/DpF一1构建的策略如简图3。PeR扩增的1.4kbnNAP一NI分别经EeoRI/BamHI双酶切(如图4)、纯化及T4DNA一。，

得三个大量增殖的克隆，它们分别被命名为Bl沮eL留eGFP一DPF一1、BS/HeLa/eGFP一DPF一1和CS/HeLa/eGFP一DPF一l，简称为BI、BS和CS。通过激光共聚焦摄影(图6)，显示转染细胞胞质内合成大量绿色荧光蛋白，并明显可见带荧光的蛋白颗粒，细胞核区未观察到荧光。各克隆细胞传代5次后，经RT一PCR鉴定，BS和CS细胞株总RNA反转录扩增产物与重组质粒pEGFP一Nl/DPF一1所含插入片段大小一致，同时从Bl、BS和CS均扩增出一条较小的片段(图7)。对BS克隆细胞培养上清液的WestemBlorting分析显示，抗该绿色荧光蛋白的抗体识别rEGFP，并在转染细胞培养上清液中特异地识别出一条分子量约为120
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

【引证文献】

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1 颜桂军;早胚发育促进因子-1作用靶分子的筛选大鼠卵母细胞能在联合培养系统中成批成熟[D];复旦大学;2005年

本文编号：2701306