抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究

发布时间：2020-06-10 22:37

【摘要】： 血小板血栓形成是血管闭塞性疾病的主要成因。其表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集最终共同途径的关键要素。阻断GPⅡb/Ⅲa 与纤维蛋白原的结合，能高效地抑制血小板的聚集，进而使血小板血栓不能形成。SZ-21是我室制备的一株针对GPⅢa的单克隆抗体，经家兔颈动—静脉血栓模型证实能显著降低血栓形成，显示了在抗血栓治疗中的潜在价值。为降低鼠源性单抗免疫原性（HAMA）及全抗体Fc 段对血小板的破坏，本研究将SZ-21制备成小分子抗体，并对这一抗体片段进行了纯化、复性和体外性质的研究。一 SZ-21单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从分泌抗血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ-21杂交瘤细胞中克隆了该抗体的重、轻链可变区（V区）基因，，并测序分析。SZ-21重链（V_H）基因全长为342 bp，轻链（V_L）基因全长为306 bp，分别编码114和102个氨基酸。基因序列登录号为VH：AF354053，VL：AF354054。二 SZ-21单链抗体（SZ-21ScFv）基因的筛选和表达为最大限度地保留单链抗体的血小板结合活性，利用噬菌体展示技术进行了高亲和力筛选。将SZ-21 V_H和V_L基因分别与含有（Gly_4Ser）_3多肽接头的载体pSW1-ScFv连接，构建成单链抗体基因 pSW1-SZ21ScFv，克隆到噬菌体分泌型表达载体pHEN1中。同时亲和层析纯化血小板膜糖蛋白Ⅲa，用糖蛋白Ⅲa作为抗原进行高亲和力筛选。经过四轮“吸附—洗脱—扩增”的富集过程，phage-ELISA 得到一个具有与血小板高亲和力的克隆，转化E.coli HB2151，表达了可溶性ScFv融合蛋白。ELISA和Western blot证实该融合蛋白保留了亲本抗体的血小板结合特性。三 SZ-21单链抗体高效表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达将上述筛选得到的单链抗体基因亚克隆到大肠杆菌融合型表达载体pET20b中，得到pET20b-21ScFv。通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究摘要 BLZI（DE3）PlysS中表达了功能分子。SDS－PAGE和 Western blot显示表达产物的分子量为27000。该融合蛋白除少量为分泌型表达外，主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的 21％，约 20 m叭。同时探索了该抗体片段的最佳复性条件。把包涵体形式表达的 SZ上单链抗体片段用尿素溶解，经过蛋白质的体外重折叠复性过程，成功地得到具有活性的单链抗体片段。ELISA和Western印迹检测证实，该鱼链抗体保留了与血小板特异结合的能力。四SZ毛的纯化和体外性质研究通过NINTA树脂亲和吸附纯化，获得具有活性的高纯度单链抗体片段，纯度达95％以上。流式细胞仪检测证实该单链抗体能与人脐静脉内皮细胞和血小板反应。体外实验表明，SZ2 单链抗体能够抑制 ADP诱导的血小板聚集，其抑制能力呈剂量依赖性，其 IC刃为 12 ug／mL，在浓度为20 ug／mL时达到最大抑制率。对花生四稀酸诱导的血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ上单链抗体同样能够抑制纤维蛋白原与血小板的结合，显示了其抗血栓作用。以上结果表明，制备的基因工程抗体具有原鼠单克隆抗体的抗血栓形成能力，减少了全抗体的人抗鼠抗体反应（HAMAh 同时该小分子抗体片段去除了抗体的FC段，避免鼠源性单克隆抗体引起血小板严重下降的副作用。该单链抗体有望用于抗血栓治疗。五抗血小板膜糟蛋白单抗SZ毛嵌合Fab片段基因构建和表达研究利用基因克隆技术，从杂交瘤细胞系 SZ上中克隆出轻、重链可变区基因，然后亚克隆到含有人恒区基因C＊和C。的质粒pSWIFab 中，构建成人一鼠嵌合Fab抗体片段质粒pSZ2，在大肠杆菌中表达了可溶性＊b抗体片段。SDS－PAGE显示在分子量（Mr）45 000处有一诱导条带，与该嵌合抗体的理论计算值相符。表达量约为 800 fig／L， ELISA和Western检测证实表达产物具有与血小板结合的活性。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392-33

【参考文献】