衰老成纤维细胞中Stat3的核定位及其对AngⅡ诱导TIMP-1表达上调的作用

发布时间：2020-06-11 10:31

【摘要】： 衰老(Senescence)是指在细胞、组织水平的生理机能的进行性丢失，是众多不同的生理刺激激发细胞出现的一种最终的共同状态。大量实验证明信号通路与衰老的起始和持续密切相关。本实验以用于研究体外复制衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞为模型，探讨细胞复制衰老过程中JAK／STAT信号通路的主要成员Stat3活性的变化、MMPs／TIMPs系统的变化、AngⅡ的作用及AngⅡ调控下游基因表达的有关信号通路，揭示衰老发生的机制。 第一部分实验采用Western blotting、间接免疫荧光和EMSA等方法。结果显示：AngⅡ通过其AT_1受体诱导WI-38细胞Stat3、Stat1的磷酸化，形成以磷酸化的Stat3同源二聚体SIF-A为主的复合物转位入核；AngⅡ以量效、时效的方式诱导SIF-DNA的结合，10~(-7)M或10~(-6)M的AngⅡ刺激细胞60min能够最大强度的诱导SIF-DNA的结合，说明AngⅡ能够活化WI-38细胞中JAK／STAT信号通路。 第二部分实验结果显示，细胞在复制衰老过程中，，Stat3的活性组成型或生长因子刺激后都有改变。应用Northern blotting检测了年轻细胞和衰老细胞中Stat3 mRNA的表达，结果发现衰老细胞中Stat3 mRNA的表达与年轻细胞比无明显的差别，而Western blotting示衰老细胞中Stat3蛋白的 第四军医大学博士研究生论文 表达明显高于年轻细胞，其活性形式磷酸化的Stat3中Stat3）的表达也不 低于年轻细胞；Aug 11刺激细胞后，无论年轻细胞还是衰老细胞，Aug 11 都能以同样强度诱导胞浆中Stat3的磷酸化，但在衰老细胞核中，无论是 组成型的或Aug 11刺激后的，pstat3蛋白水平都明显低于年轻细胞，提示 衰老细胞中pstat3转位入核受阻；在衰老细胞中，Aug 11同样以量效、时 效的方式，通过其AT；受体诱导Sff－DNA结合，10”’M的Aug 11刺激衰老细 胞45－60min能够最大强度的诱导Sff－DNA的结合。由前两部分实验结果可 推测出细胞复制衰老过程中，信号转导分子与基因组DNA结合活性所发 生的变化，可能影响下游基因的表达。 第三部分实验的明胶酶谱结果显示：WI－3 8细胞主要分泌 MMP－2， 且年轻细胞中的MMP－2活性明显强于衰老细胞，年轻细胞和衰老细胞中 ＊＊P9的活性均较弱，两者之间无明显差别：An gll刺激细胞48h时， 年轻细胞和衰老细胞中MMP－二的活性稍有增加，两者之间无差别，而 Aug 11对 MMP一的活性无明显影响。衰老细胞中组成型的 TIMP上的表 达明显高于年轻细胞，且 Aug 11可明显上调衰老细胞 TIMPq的表达，在 Aug 11刺檄衰老细胞 6h时，TWl蛋白的表达己开始上调，12h达峰值， 48h时降至基础水平。考虑到TIMP刁启动子区含有S丁结合位点，Aug 11有可能通过STAT通路调控TM－l的表达，为此进行了细胞转染实验， 结果显示转染Stat3反义质粒、Stat3显性负调突变体质粒及Stat3反义寡 核苦酸的衰老细胞，用 Aug 11刺激后，上调的 TIMP＊的表达明显受抑， 说明 Aug 11通过 STAT通路上调衰老细胞 TIMP刁的表达。由此可以想象 在衰老细胞中TIMP－l等的组成型表达或生长因子诱导表达增加，可通过 抑制MMP－9的活性来促进维持正常状态，形成衰老特异的生理、形态的 变化。在细胞衰老过程中，M：MPs／TIMPS比率的下降，通过抑制永生细 胞的出现，在避兔肿瘤的形成中起着主要的作用。推测下调TIMP－l等表 4 达的细胞因子或生长因子可能与肿瘤的发生有关。相反，上调TIMP－1表 达的可能与衰老或硬化有关。 总之，细胞复制衰老过程中Stat3活性下降，不是衰老细胞Stat3磷 酸化的减少，而是活化的 Stat3核转位受阻；Aug 11可以诱导衰老细胞 Stat3．DNA的结合；WI－3 8细胞主要分泌 MMP－2，其活性在衰老细胞中 明显低于年轻细胞；衰老细胞TIMPl 蛋白的表达明显高于年轻细胞， Aug 11能够上调衰老细胞 TIMPl的表达，这一作用依赖于 Stat3的活化。 从本实验可以看出，STAT信号通路介导了衰老信号，参与调控下游基因 的表达。本研究初步揭示了衰老细胞形态、生理功能发生改变的分子机 制，Aug 11参与衰老的机理，提示通过应用 ACEI或 ATI RA阻断 RAS系 统，直接或间接干预 Aug 11的信号通路，可阻滞 Aug 11上调 T侧l的表 达，有可能成为延缓衰老、组织硬化进程的有效方法。
【图文】：

图1.4.EMsA检测Angn诱导wl一38细胞sIF.DNA结合的量效、时效作用及特异性.不同浓度的劫911(l)oM，对照:(2)10一‘M:(3)10一7M:(4)10一喻:(5)10一，M作用于细胞3伽rnjn;10一喻的劫911刺激细胞不同时间(6)omin，对照;(7)15n五n;(s)3伍nin;(9妙smm:(10)60min;(11)gotnjn;(12)120n五n;(13)10一SM的灯，受体阻断剂valsartan先作用于细胞30mill后，10一6M的Angn再刺激细胞30r正n;(14)10一SM的AT:受体阻断剂cGP42112A先作用于细胞30t川n后，10一MAngn再刺激细胞30n五n;(l5)50倍非标记特异探针竞争拮抗;(16)非特异探针NF一KB.同位素标记的探针，可完全拮抗活化的S正与标记探针的结合，而加同样数量的非特异的探针NF一KB并无此影响，说明形成的SIF复合物与DNA探针之间的结合是特异的。并且Angll诱导的s正一DNA结合，可被ATI受体阻断剂、恤lsartan所阻断，但并不受ATZ受体阻断剂CGP42112A的影响，进一步说明Angn诱导Wl一38细胞stat3、Statl的活化是通过其ATI受体介导的(图1.4)。，

第四军医大学博士研究生论文)，表明S正复合物由p一stat3和p一statl，Angn刺激wi一38后，主要诱导以p一st次p一stat3和p一statl形成的异源二聚体，而p一statl形成的同源二聚体sIF一C含+.+++lA且911一。一6M一+
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R339.38

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本文编号：2707771