载脂蛋白E及其基因多态性对星形胶质细胞缺氧性损伤的影响及相关机制研究

发布时间：2020-06-11 17:44

【摘要】：载脂蛋白E（Apolipoprotein E,APOE表示其基因，apoE表示其编码蛋白）是中枢神经系统最主要的载脂蛋白，主要由星形胶质细胞产生。近年来，APOE基因多态性在脑损伤后继发性病理生理改变以及伤后转归中的作用越来越被更多的国内外学者所关注，普遍认为携带APOEε4等位基因的患者脑损伤易损性增加，并且可导致不良预后，但是相关机制目前仍不甚明了。 缺氧是引起中枢神经系统细胞损伤最常见的原因，是脑创伤、缺血性卒中等疾病的基本病理过程。研究发现，星形胶质细胞缺氧后释放的多种细胞毒性介质对周围神经元可产生明显的损伤。越来越多的研究表明，星形胶质细胞结构和功能的改变在诸多疾病，如脑水肿、炎性脱髓鞘疾病、中枢神经系统退行性疾病等发病机制中扮演了重要的角色。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞。然而目前对神经保护的研究主要集中于对神经元的保护，对其他非神经元细胞如星形胶质细胞的保护研究却少见报道。本课题以星形胶质细胞为研究对象，模拟脑损伤后脑组织缺血缺氧这一病理生理改变，探讨了apoE在此过程中的作用。本课题主要包括以下四方面的研究： 一、星形胶质细胞的原代培养及缺氧损伤模型的建立 采用酶消化法原代培养APOE基因敲除（APOE KO）鼠、APOE基因野生（APOE WT）鼠的星形胶质细胞、并纯化鉴定；参照相关文献，予细胞缺氧6h，构建星形胶质细胞缺氧损伤模型，透射电镜观察细胞超微结构形态变化。结果：光镜显示，细胞呈“铺路石”样排列，胞体较大呈不规则形，细胞免疫荧光发现，细胞能被抗GFAP的抗体识别；缺氧6h后，通过电镜均观察到细胞足突肿胀，线粒体形态不规则，空泡化，嵴不规则，可见细胞核凝集，染色质固缩、以及凋亡小体等凋亡细胞明显特征。结论：本部分实验成功构建了细胞的缺氧损伤模型，，为后续实验奠定了基础。 二、 apoE对星形胶质细胞缺氧性损伤的保护作用及机制研究 1.将培养成熟的APOE KO及APOE WT星形胶质细胞均分为常氧组、缺氧组、常氧+T0901317组、缺氧+T0901317组，后两组细胞均为在常氧/缺氧前48h，向细胞培养基中加入促进apoE蛋白表达增加的肝X受体（liver X receptor，LXR）激动剂T0901317,并使其在培养基中的浓度为300nM。流式细胞仪分别检测以上各组细胞凋亡率情况。2.将培养成熟的APOE KO星形胶质细胞按照向其培养基中加入外源性apoE3的浓度分成6组：空白组、100nM组、300nM组、1000nM组、2000nM组、3000nM组，apoE3于缺氧前30min加入，予各组细胞缺氧6h后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率情况。3.将培养成熟的APOEKO及APOE WT星形胶质细胞均分为常氧组、缺氧组、常氧+T0901317组、缺氧+T0901317组，后两组细胞均为在常氧/缺氧前48h，向细胞培养基中T0901317,并使其在培养基中的浓度为300nM。缺氧6h后，收集各组细胞的细胞外液，通过氨基酸自动分析仪检测各组细胞外液中谷氨酸的水平。4.将培养成熟的APOE KO星形胶质细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+apoE3组、缺氧+MK801组、缺氧+apoE3+MK801组，后3组在缺氧前30min分别向培养基中加入人重组apoE3（1μM）、NMDA受体拮抗剂MK801（10μM）、apoE3（1μM）+MK801（10μM），流式细胞仪分别检测以上各组细胞凋亡率。5.将培养成熟的APOE KO及APOE WT星形胶质细胞均分为对照组、谷氨酸组、对照+T0901317组、谷氨酸+T0901317组，谷氨酸组为向培养基中加入谷氨酸（50mM），对照组即不作任何处理，保持原培养条件不变，后两组为在未加入/加入谷氨酸前48h，向培养基中加入LXR激动剂T0901317（300nM）；以上各组予继续培养24h；流式细胞仪分别检测以上各组细胞凋亡率。结果：1.缺氧6h后，APOE KO缺氧组细胞凋亡率明显高于APOE WT缺氧组(p0.05)；T0901317能明显降低APOE WT缺氧组细胞凋亡率(p0.05)，但是对APOE KO缺氧组无明显作用（p＞0.05）。2.从300nM组开始，细胞凋亡率较空白组明显降低(p0.05)，1000nM组细胞凋亡率最低。3.缺氧后6h，APOE KO组、APOE WT组细胞外液中谷氨酸浓度较常氧组明显增加(p0.05)，且APOE KO缺氧组明显高于APOEWT缺氧组(p0.05)；T0901317能明显降低APOE WT缺氧组细胞外液中谷氨酸浓度(p0.05)，但是对APOE KO缺氧组无明显作用（p＞0.05）。4.与常氧组相比，缺氧组、缺氧+apoE3组、缺氧+MK801组、缺氧+apoE3+MK801组细胞凋亡率均明显增加(p0.05)，外源性加入apoE3或（和）MK801后，细胞凋亡率较单纯缺氧组明显降低(p0.05)，但是apoE3、MK801对细胞缺氧性损伤的保护作用相似，且两者作用不叠加。5.谷氨酸处理24h后，APOE KO组、APOE WT组细胞凋亡率较对照组明显增加(p0.05)，且APOE KO缺氧组明显高于APOE WT缺氧组(p0.05)；T0901317能明显降低APOE WT谷氨酸组细胞凋亡率(p0.05)，但是对APOE KO谷氨酸组无明显作用（p＞0.05）。结论：apoE对星形胶质细胞缺氧性损伤具有保护作用，且这种保护作用具有剂量-反应关系。apoE可抑制星形胶质细胞缺氧后NMDA受体的过度激活，降低谷氨酸的毒性，增加星形胶质细胞apoE的表达可能是缺氧性神经损伤保护的一种新途径。 三、 apoE在星形胶质细胞缺氧性损伤中的表达变化及其机制 将培养成熟的APOE WT鼠的星形胶质细胞分为常氧组、缺氧组和干预组（缺氧+ERK抑制剂），分别予缺氧组和干预组缺氧6h，干预组在缺氧之前向培养基中加入ERK信号通路抑制剂U0126， Westernblot法分别检测检测三组细胞apoE蛋白表达变化情况。结果：与常氧组和干预组相比，缺氧组星形胶质细胞表达的apoE蛋白明显增加(p0.05)。结论：缺氧使星形胶质细胞apoE蛋白水平表达上调，ERK信号通路参与了该调节过程。 四、 APOE基因多态性在星形胶质细胞缺氧性损伤过程中的作用 1.原代培养APOE WT鼠、APOE转基因鼠（ε3、ε4）的星形胶质细胞，纯化鉴定，并构建6h细胞缺氧损伤模型；2.采用流式细胞仪分别检测各组细胞凋亡率及线粒体膜电位变化情况。结果：APOEε4组细胞早期凋亡率、线粒体膜电位下降程度明显高于APOEε3、APOE野生鼠组(p0.05)。结论：缺氧损伤后早期，与APOEε3、APOE野生鼠组相比，APOEε4组星形胶质细胞线粒体膜电位下降程度更大，这可能导致更多的星形胶质细胞凋亡。
【图文】：

对培养成熟纯化的星形胶质细胞进行倒置显微镜形态学观察：细胞外观扁积较大，贴壁细胞呈典型的“铺路石” 样排列（图 1A）；GFAP 免疫荧光染色质中明显的胶质丝，胞核空染呈空泡状（图 1B）。通过对每一观察视野内 G色阳性细胞占总细胞数的比例统计，星形胶质细胞纯度几可达 100%。

图 2 星形胶质细胞缺氧 6h 后超微结构变化。A：正常细胞；B:缺氧 6h 后胞质中肿胀线粒体（箭头示）；C：缺氧 6h 后可见凋亡小体。（标尺：1μm）Fig. 2 Ultrastructure of astrocytes exposed to hypoxia for 6h. (A) Control cells; (B) Swollenmitochondria were observed in the cytoplasm (arrowhead); (C) Apoptotic bodies were found in 6hischemic astrocytes. Scale bar = 1μm.4 讨论1846 年，Rudolf Virchow 首次描述并命名神经胶质细胞(neuroglia)，他认为其作用类似于结缔组织,可将神经成份粘合在一起,因此命名为神经胶质。经过一个半世纪的研究，目前人们对胶质细胞的形态结构及功能有了更为深刻的认识,不仅认为胶质细胞具有为神经元提供营养与支持作用,而且它在神经系统的发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫及多种神经疾病的病理机制等方面,都起着十
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411

【引证文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 周静;ApoE在小鼠脊髓损伤修复过程中的表达变化及其对星型胶质细胞的作用研究[D];昆明医科大学;2017年

2 张娜;高糖缺氧通过增加UCP2表达和线粒体凋亡途径加重星形胶质细胞损伤[D];宁夏医科大学;2016年

本文编号：2708240