内皮细胞1-磷酸鞘氨醇受体2表达的调节

发布时间：2020-06-12 19:07

【摘要】：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是一种存在于血浆中的具有生物活性的神经鞘磷脂。S1P主要由血小板合成和分泌,其他细胞如红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞以及内皮细胞都能够分泌S1P。S1P在细胞内可作为第二信使,与调节性分子如酶、通道蛋白、转录因子等相互作用而发挥效应;S1P还可以作为细胞外配体,与几乎存在于所有细胞种类的S1P膜受体结合,并通过不同的信号转导通路,影响细胞的生存、增殖、分化、迁移、血管生成等,发挥广泛的生物学效应。S1P受体为G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR),目前至少发现有5种,分别为S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5,分布于不同的细胞。内皮细胞主要表达S1PR1、S1PR2和S1PR3。不同亚型的S1P受体结合的G蛋白不尽相同,其中S1PR1与Gi相偶联,S1PR2/3则与Gi、Gq、G12/13偶联。另外,S1PR1和S1PR2/3对S1P的亲和力也有区别,生理浓度下(0.5～1 μmol/L) S1P主要与S1PR1结合;浓度较高则与S1PR2/3结合。有研究发现,生理浓度下S1P与S1PR1结合,介导Racl依赖的内皮屏障保护作用;浓度较高时,则与S1PR2/3结合,介导RhoA依赖的内皮屏障损伤作用。本课题组前期研究结果显示,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)诱导皮肤微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells, HMVECs)炎性反应过程中,S1PR2的表达增加,内皮单层细胞通透性增高,S1PR2的特异性拮抗剂JTE-013可以明显降低TNF-α引起的内皮单层细胞高通透性。此研究结果与Sanchez T等人的一致,他们发现,在脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),S1PR2的表达增多导致内皮单层细胞的通透性升高,内皮屏障功能降低,JTE-013可以明显抑制H202引起的肺高通透性及肺水肿。以上结果均提示S1PR2的表达增加参与介导了内皮屏障功能障碍。本研究也发现TNF-α诱导HUVECs炎性反应过程中,S1PR2的蛋白表达水平升高。那么炎性刺激下S1PR2表达增多的机制是什么?调控S1PR2的表达是否会调节内皮细胞的屏障功能进而影响炎症反应的进程呢?本文旨在探讨影响S1PR2表达的上游调控因素,以较全面了解S1PR2在内皮细胞的表达调节。肝X受体(liverXreceptors,LXRs)是孤核受体家族成员,充当转录因子的角色。LXRs有两种亚型:LXRα和LXRβ。LXRα的表达具有组织特异性,它在肝脏表达最高,在肝脏、肾上腺、肠、脂肪、巨噬细胞、肺和肾较低表达,而LXRβ几乎在所有组织中都有表达。Li Z等人发现LXRα/β在肝内皮细胞和枯否细胞高表达。SpillmannF等人发现LXR-α、LXR-β和RXR-α在脐静脉内皮细胞中有表达。LXRα和LXRβ两个亚型具有相同的激活配体。内源性配体主要为胆固醇在体内代谢的衍生物氧化甾醇;外源性人工合成激动剂有T0901317、GW3965等。LXR被内源性配体或人工合成激动剂激活后,需与视黄醇类X受体(retinoid X receptor,RXR)结合形成异二聚体(LXR/RXR),方具有转录因子活性。RXR包括α、β、γ三种亚型,该受体通过形成同源二聚体或与其它核受体形成异二聚体,参与细胞的信号转导。RXR的天然配体是9-顺式视黄酸(9-cis RA)。LXR的配体和RXR的配体均可以激活LXR/RXR异二聚体,该异二聚体通过与靶基因的LXR反应元件(LXR response element,LXRE)的特定核苷酸序列结合,上调相关基因的表达。三磷酸腺苷结合盒转运体 A1 (ATP-binding cassette transporterA1,ABCA1)是大家公认的 LXR/RXR 的靶基因,当LXR和(或)RXR被激活时,LXR/RXR的转录活性将增强,进而会增加ABCA1mRNA的表达,因此本研究通过检测ABCA1mRNA水平来反映LXR激动剂或RXR激动剂对HUVECsLXR/RXR转录活性的影响。研究显示LXR激动剂T0901317具有抗动脉粥样硬化作用,一方面它能够上调脂代谢关键基因(如ABCA1)的表达,进而调节胆固醇分解、储存、吸收和转运,从而维持脂质的动态平衡,抑制动脉粥样硬化的发生发展;另一方面,近年来研究显示,它能够抑制一些经典的炎症性基因(如iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3 (MCP-3)和非金属蛋白酶等)的表达,通过抗炎和免疫调节作用,抑制动脉粥样硬化的发生发展。但是目前关于LXRs抗炎机制的研究多集中在巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞及基因敲除动物,疾病动物模型等,而在血管内皮细胞罕有报道。本研究拟以血管内皮细胞为靶细胞,研究LXR/RXR是否能够通过调节S1PR2的表达,影响内皮屏障功能,进而控制炎症反应的进程。通过这项研究,我们希望为临床上炎症性疾病的治疗找到新的靶点。基因表达的调控有多种方式,其中就包括微小RNA (microRNA,miRNA)对基因的转录后调控。miRNAs是一类长约21～23个核苷酸非编码RNA。miRNA通过与靶信使RNA (messenger RNA,mRNA)的 3' 端非编码区(3,-untranslated region,3 -UTR)序列非完全互补配对结合,抑制靶mRNA的翻译和/或降解靶mRNA。研究显示miRNA的表达异常与癌症、心血管疾病与糖尿病等疾病均密切相关,必将在疾病的诊断与治疗上扮演重要的角色。S1PR2的表达是否接受miRNA调节,关键在于S1PR2的3'-UTR有没有miRNA的潜在结合位点。通过生物信息学软件预测,人S1PR2的3'-UTR (全长约2.4kb)中含有多种miRNA的潜在结合位点,它们分别是miR-130/301、miR-19、miR-96/1271 和 miR-182, miR-24-3p 等,提示 S1PR2 的基因表达可能受miRNAs的调节。本研究还将从miRNA的角度出发,分析S1PR2表达的转录后调节。目的:本研究以脐静脉内皮细胞为靶点,研究转录因子LXR/RXR是否能够通过调节S1PR2的表达进而影响内皮细胞的通透性。本研究还将从miRNA的角度进一步探讨LXR/RXR调节S1PR2表达的具体机制,通过这项研究,我们希望为临床上炎症性疾病的治疗找到新的靶点。方法:本研究以HUVECs为研究对象,采用western blot技术检测S1PR2、LXR-α、RXR-α等蛋白表达水平的变化;采用跨细胞电阻仪检测内皮单层细胞跨膜电(trans-endothelial electric resistance,TEER),以反映内皮单层细胞通透性;采用实时荧光定量PCR技术检测microRNA及ABCA1mRNA水平的变化;ABCA1mRNA水平的变化被用来反映LXR激动剂或RXR激动剂对HUVECs LXR/RXR转录活性的的影响;采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的活性以反映转录因子RXR-α与S1PR2启动子片段的结合能力及miR-130a-3p与S1PR2的3'-UTR的结合能力。本研究所有数值均用平均值±标准差表示。使用SPSS 13.0软件进行数据统计,统计方法采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)或独立样本 t 检验(Independent-samples t Test)进行分析,方差不齐时则采用Dunnet's T3方法。以P0.05为差异有统计学意义。结果:1. TNF-α使内皮细胞S1PR2的表达增加本课题组前期研究结果及他人研究结果均提示内皮细胞S1PR2的表达增加参与介导了内皮屏障功能障碍。为了验证HUVECs炎性反应过程中S1PR2的表达是否增多,本实验用细胞因子TNF-α (100 ng/ml)刺激细胞不同时间(1,3, 6,12,24 h),western blot检测S1PR2的表达。结果显示,TNF-α分别刺激不同时间后,各组S1PR2蛋白的表达差异有统计学意义(F=8.407, P=0.000)。TNF-α刺激12 h时可观察到S1PR2蛋白表达水平升高(P=0.005),刺激24 h时S1PR2表达仍维持在较高水平(P=0.000),提示S1PR2在HUVECs炎性反应过程中确实也起着非常重要的作用。那么炎性刺激下S1PR2的表达为什么会发生这样的改变,控制S1PR2的表达是否会通过影响内皮细胞的通透性,进而影响炎性反应的进程呢?本研究接下来将主要探讨S1PR2在内皮细胞的表达调节。2. TNF-α通过LXR/RXR实现对S1PR2的表达调节(1)生物信息学软件初步预测转录因子LXR/RXR可能调控S1PR2基因的表达生物信息学软件预测到RXR-α在S1PR2基因启动子区有结合位点,提示LXR/RXR可能通过RXR-α与S1PR2启动子区结合并发挥调控作用。我们假设:在静息的HUVECs,LXR/RXR对S1PR2的表达有抑制作用。TNF-α诱导HUVECs炎症反应过程中,LXR/RXR的转录活性降低,从而在一定程度上解除了其对S1PR2表达的抑制,导致S1PR2表达增多,从而减弱内皮细胞的屏障功能。接下来我们将对此进行验证。(2)TNF-α可通过减少LXR-α的表达从而抑制LXR/RXR的转录活性为了研究TNF-α对LXR-α表达的影响。本研究用TNF-α ( 100 ng/ml)刺激HUVECs不同时间,采用western blot技术检测细胞中LXR-α的表达水平,结果显示TNF-α分别刺激不同时间后,各组LXR-α的表达差异有统计学意义(F=4.449,P=0.05)。TNF-α作用24 h能够显著减少LXR-α的表达(P=0.015),而且在观察时间内TNF-α的抑制作用具有时间依赖性。提示TNF-α能够减少LXR-α的表达。当LXR-α表达减少时,LXR/RXR的转录活性也会受到抑制,则必然会降低其靶基因ABCA1 mRNA水平。用TNF-α (100 ng/ml)刺激HUVECs不同时间,采用实时荧光定量PCR技术检测HUVECs中ABCAlmRNA的表达水平,结果显示TNF-α分别刺激不同时间后,各组ABCAlmRNA的表达差异有统计学意义(F=429.092, P=0.000)。TNF-α 作用于 HUVECs 3 h 即可抑制 ABCA1mRNA 的表达(P=0.000),作用6 h时抑制效果更加显著(P=0.000),作用12 h, 24 h时仍能维持显著的抑制效果(P=0.000)。提示TNF-α确实能够通过减少LXR-α的表达,抑制LXR/RXR的转录活性,从而降低ABCA1mRNA水平。那么前期结果中我们观察到的TNF-α使内皮细胞S1PR2的表达增加是否与此相关呢?(3) LXR/RXR活性的变化可影响S1PR2蛋白的表达①激活LXR/RXR的转录活性可抑制S1PR2蛋白的表达因为为了确定LXR、RXR激动剂是否能够激活HUVECs LXR/RXR的转录活性,本研究用 LXR 激动剂 T0901317 (20μmol/L)和 GW3965 (2μmol/L)及RXR激动剂9-cis RA (1 μmol/L)分别作用于HUVECs不同时间(6、12、14h),采用实时荧光定量PCR技术检测HUVECs中ABCA1 mRNA的表达水平,结果显示各激动剂组ABCA1mRNA的表达差异均有统计学意义(F值分别为205.582、2230.686、470.416; P值均为0.000)。三种激动剂作用6 h (P值均为 0.000),12 h (P值均为 0.000), 24 h (P 值均为 0.000)均上调 ABCA1 mRNA表达水平。提示LXR、RXR激动剂均能够激活LXR/RXR的转录活性,LXR和RXR在HUVECs中均具有生物学功能。为了探讨LXR/RXR被激活后对S1PR2蛋白表达的影响,本实验分别观察了 T0901317、GW3965、9-cisRA影响S1PR2蛋白表达的剂量效应和时间效应。用不同浓度的LXR激动剂T0901317 ( 2、5、10、20 μmol/L )作用于HUVECs 24 h,用western blot技术检测S1PR2蛋白的表达。结果显示T0901317不同剂量组之间差异有统计学意义(F=5.432, P=0.003)。20μmol/LT0901317能够抑制S1PR2蛋白的表达(P=0.001)。用20μmol/LT0901317作用于HUVECs不同时间(12、15、18、21、24 h),结果显示T0901317不同时间组之间差异有统计学意义(F=28.062, P=0.000)。20 μmol/L T0901317 作用 15 h 即可抑制 S1PR2蛋白的表达(P=0.008),作用18h、21h、24h均表现出显著的抑制效应(P值均为0.000)。而且在所观察的24 h内,T0901317的抑制效应呈时间依赖性。用不同浓度LXR另一激动剂GW9365 (0.5、1、2μmol/L)作用于HUVECs 24 h,用western blot技术检测S1PR2蛋白的表达。结果显示GW9365不同剂量组之间差异有统计学意义(F=20.011,P=0.000)。0.5、1、2 μmol/L GW9365均能够抑制S1PR2的表达(P值分别为0.025、0.000、0000),而且GW9365的抑制作用呈剂量依赖性。用2 μmol/L GW9365作用于HUVECs不同时间(12、18、24 h),结果显示GW9365不同时间组之间差异有统计学意义(F=5.198,P=0.016)。GW9365作用18 h即可抑制S1PR2蛋白的表达(P=0.045),24 h时抑制效果更加显著(P=0.004),而且在所观察的24h内,其抑制作用具有时间依赖性。用不同浓度的RXR激动剂9-cisRA (0.1、1、2、5、10 μμmol/L)作用于HUVECs 24 h,用western blot技术检测S1PR2蛋白的表达。结果显示9-cis RA不同剂量组之间差异有统计学意义(F=6.003, P=0.003)。0.1 μmol/L 9-cisRA即能够抑制S1PR2蛋白的表达(P=0.002),1、2、5μmol/L9-cisRA均表现出抑制效应(P值分别为0.002、0.008、0.007、0.008),而10μnol/L9-cisRA抑制效果更加显著(P=0.000)。用1μmol/L9-cisRA作用于HUVECs不同时间(6、12、18、24 h),结果显示9-cis RA不同时间组之间差异有统计学意义(F=3.535,P=0.034)。9-cis RA作用12 h、18 h可观察到抑制作用(P分别为0.018、0.016),但作用24 h时其抑制作用解除,这可能跟RXR及LXR/RXR的转录活性有关。以上结果提示,LXR、RXR激动剂分别激活LXR/RXR后均可抑制S1PR2的表达。②siRNA下调LXR或RXR的表达可增加S1PR2蛋白的表达实验分别用 60 nmol/L 的 LXR-α siRNA 或 20 nmol/L 的 RXR-α siRNA 及其相应负对照转染HUVECs 60 h,用western blot技术检测LXR-α、RXR-α及S1PR2蛋白的表达。结果显示,与转染对照组相比,转染组细胞LXR-α和RXR-α的表达分别被抑制(t值分别为7.367、3.370; P值分别为0.000、0.015), S1PR2的蛋白表达均增多(t值分别为-4.145、-3.120; P值分别为0.014、0.045)。提示小分子RNA干扰LXR-α或RXR-α表达后均上调S1PR2的表达。综上所述,激活LXR/RXR的转录活性可抑制S1PR2的表达,而小分子RNA干扰LXR-α和RXR-α的表达均可上调S1PR2的表达,提示LXR/RXR能够调控S1PR2的表达。3.LXR/RXR的活性变化对内皮屏障功能的影响研究表明S1P浓度较高时与S1PR2结合,介导RhoA依赖的屏障损伤作用。本课题组前期研究已证明给予过量的S1P (10 μmol/L)引起内皮屏障功能的损伤,通透性升高。本研究也已经证实LXR/RXR的激活可下调S1PR2的表达。本研究主要观察LXR/RXR的激活是否可减轻S1PR2介导的过量S1P引起的内皮细胞屏障功能的损伤。实验中先分别给予细胞 T0901317 (20 μmol/L)、GW3965 (2 μmol/L)、9-cisRA (1μmol/L)刺激,18h后换液,再给予S1P (10μmol/L)刺激,然后用电阻检测仪检测 S1P 刺激 0min,5min,10min,20min,30min,40min,50 min, 60 min时的跨内皮细胞电阻(TEER)。结果显示:空白对照组、S1P刺激40min组与T0901317组TEER差异有统计学意义(F=8.232,P=0.006)。S1P刺激40 min 可引起TEER降低(P=0.004),而预先给予T0901317可显著抑制TEER的降低(P=0.007)。空白对照组、S1P刺激50min组与GW365组TEER差异有统计学意义(F=8.980, P=0.004)。S1P刺激50min可引起TEER降低(P=0.002),预先给予GW3965 可显著抑制TEER的降低(P=0.006)。空白对照组、S1P刺激30 min组与9-cis RA组TEER差异均有统计学意义(F=4.662,P=0.032)。S1P 刺激 30 min 可引起 TEER 降低(P=0.016),预先给予9-cisRA可显著抑制TEER的降低(P=0.043),以上结果提示LXR/RXR的激活通过抑制S1PR2的表达能够减轻过量S1P引起的内皮单层细胞高通透性,保护内皮屏障功能。4.LXR/RXR通过miR-130α-3p实现对S1PR2的表达调节(1)观察转录因子LXR/RXR能否通过RXR-α和S1PR2基因的启动子区发生相互作用生物信息学软件预测结果显示,S1PR2启动子区(转录起始点上游2KbP)没有LXR-α、LXR-β的结合位点,但有RXR-α的结合位点。我们假设LXR/RXR可能通过RXR-α与S1PR2基因启动子区结合从而发挥直接的的调控作用。对此我们通过双荧光素酶报告基因检测系统进行了验证。结果显示,转录因子RXR-α对含S1RP2启动子片段(转录起始点上游2KbP)的基因表达水平无直接调控作用。因此我们考虑LXR/RXR可能通过其它途径调节S1PR2的表达。为了更加全面了解其调控机理,本研究从miRNA的角度进一·步探讨LXR/RXR调控S1PR2表达的机制。(2)筛选既能够靶向调控S1PR2的表达,又能被LXR/RXR调控的miRNAs通过生物信息学软件预测分析,我们初步筛选到miR-130a-3p和miR-24-3p可能既被LXR/RXR调控又能够靶向调控S1PR2的表达。前期实验结果已证实,TNF-α能够抑制LXR/RXR的转录活性,LXR/RXR能够调控S1PR2的表达。再根据microRNA的作用特点,我们假设,静息的HUVECs能表达一定量的miR-130a-3p和miR-24-3p,对S1PR2的表达有抑制作用,而这些特定的miRNA可能也同时接受LXR/RXR的转录调控,在TNF-α诱导HUVECs炎症反应过程中,LXR/RXR的转录活性降低,使得这些miRNA的表达减少,从而在一定程度上解除了对靶基因S1PR2表达的抑制,导致S1PR2表达增多,从而减弱内皮细胞的屏障功能。接下来我们将对此进行验证。(3)激活LXR/RXR的转录活性可上调miR-130a-3p的表达由前文可知,RXR激动剂9-cisRA在较低浓度时就可以激活LXR/RXR。因此本实验选用9-cis RA来激活LXR/RXR,确定LXR/RXR的激活能否上调miR-130a-3p和miR-24-3p的表达。实验中用9-cis RA (1 μol/L)作用于细胞不同时间(1、3、6、12、24h),实时荧光定量PCR技术观察miR-130a-3p和miR-24-3p表达的变化。结果显示9-cis RA作用不同时间后,各组miR-130a-3p的表达差异有统计学意义(F=3.111,P=0.050)。与对照组相比,9-cis RA作用于细胞1 h(P=0.012)、3h (P=0.003)、6h (P=0.034)、12h (P=0.016)、24h (P=0.038)均上调miR-130a-3p的表达。9-cisRA作用不同时间后,各组miR-24-3p的表达差异无统计学意义(F=2.545, P=0.086)。提示当用RXR激动剂激活LXR/RXR的转录活性时,可上调miR-130a-3p的表达,但不能上调miR-24-3p的表达。(4) TNF-α既可以降低LXR/RXR的活性,同时也降低miR-130a-3p的表达本研究前期结果已证实TNF-α能够抑制LXR/RXR的转录活性。再结合前文的假设,我们推测TNF-α诱导HUVECs炎性反应过程中,LXR/RXR的转录活性降低将导致miR-24-3p及miR-130a-3p的表达减少。本研究对此进行了验证。把 TNF-α (100 ng/ml)作用于 HUVECs 不同时间(1、3、6、12、24 h),运用实时荧光定量PCR技术观察其对miR-130a-3p及miR-24-3p表达的影响。结果显示TNF-α作用细胞不同时间后,各组miR-130a-3p的表达差异有统计学意义(F=44.464, P=0.000)。与对照组相比,TNF-α 作用细胞 3 h (P=0.003)、6 h(P=0.000)、12h (P=0.000)、24h (P=0.000)时均可抑制 miR-130a-3p 的表达。TNF-α作用细胞不同时间后,各组miR-24-3p的表达差异有统计学意义(F=8.242,P=0.001)。与对照组相比,TNF-α作用细胞1 h (P=0.001)、3 h (P=0.015)时可观察到miR-24-3p的表达显著增多,然后逐渐恢复。提示TNF-α刺激确能导致miR-130α-3p表达的减少,但对miR-24-3p没有此作用。基于TNF-α对LXR/RXR的转录活性的影响和生物信息学预测,更提示炎性反应过程中,LXR/RXR的转录活性降低可能导致了 miR-130a-3p表达的下降。以上结果显示激活LXR/RXR的转录活性可上调miR-130a-3p的表达,但不能上调miR-24-3p的表达;LXR/RXR的转录活性降低可能导致miR-130a-3p表达的下降,但不能导致miR-24-3p表达的减少。提示LXR/RXR可调节miR-130a-3p的表达,但不能调控miR-24-3p的表达。因此在后续实验中我们选择miR-130a-3p作为我们的研究对象。5.过表达或抑制表达miR-130a-3p可影响S1PR2的蛋白表达①过表达miR-130a-3p可抑制S1PR2的蛋白表达将人工化学合成的miRNA的模拟物(miRNAmimics) (100 nmol/L)及阴性对照(mimics negative control,mimics NC) (100 nmol/L)转染至内皮细胞,24 h时实时荧光定量PCR技术检测到miR-130a-3P (t=-5660.830, P=0.000)的表达增多,提示转染成功。转染48 h时Western blot技术检测到S1PR2蛋白表达水平下降较阴性对照组有统计学差异(t=4.191,P=0.014)。提示过表达miR-130a-3P可抑制S1PR2的蛋白表达。②抑制miR-130a-3p的表达可上调S1PR2的蛋白表达将人工化学合成的miRNA的抑制物(miRNA inhibitor) (200 nmol/L)及阴性对照(inhibitor negative control,inhibitorNC) (200 nmol/L)转染至内皮细胞,24h时实时荧光定量PCR技术检测到miR-130a-3p (t=17.964, P=0.002)的表达减少,提示转染成功。转染48h时western blot技术检测到S1PR2蛋白表达水平上调较阴性对照组有统计学差异(t=-4.053, P=0.015)。提示抑制miR-130a-3p的表达可上调S1PR2的蛋白表达。综上所述,miR-130a-3p能够调控S1PR2的蛋白表达。③miR-130a-3p可直接与S1PR2的3'UTR结合并发挥抑制作用接下来我们还通过双荧光素酶报告基因实验进一步确定miR-130a-3p与S1PR2是否具有直接的相互作用关系。结果显示miR-130a-3p对含S1PR2 3'UTR的基因表达水平有抑制作用(t=2.911,P=0.027),抑制率约为21.52%。提示miR-130a-3P能够直接抑制S1PR2的蛋白表达。结论:1.TNF-α使内皮细胞S1PR2的表达增加;2.TNF-α通过LXR/RXR实现对S1PR2的表达调节;3.激活LXR/RXR的转录活性能够改善内皮屏障功能障碍;4.LXR/RXR通过miR-130a-3p实现对S1PR2的表达调节;5.miR-130a-3p能够直接抑制S1PR2的表达。综上所述:静息的脐静脉内皮细胞能够表达一定量的miR-130a-3p,对S1PR2的表达起抑制作用。在TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应过程中,LXR/RXR转录活性的降低,引起miR-130a-3p表达减少,在一定程度上解除了 miR-130a-3p对S1PR2的表达抑制,最终导致S1PR2的表达增加,内皮屏障功能减弱。
【图文】：

内皮细胞,表达调节,炎性反应,炎症反应

蛋白表达差异有统计学意义（Ｆ＝８．４０７，尸＝０．０００）。ＴＮＦ－ａ刺激１２ｈ时可观察到逡逑Ｓ１ＰＲ２蛋白表达水平升高（尸＝０．００５），刺激２４邋ｈ时Ｓ１ＰＲ２的表达仍维持在较高逡逑水平（Ｐ＝０．０００）（见图４），提示Ｓ１ＰＲ２在ＨＵＶＥＣｓ炎性反应过程中确实也起着逡逑非常重要的作用。逡逑那么炎性刺激下Ｓ１ＰＲ２的表达增多的机制是什么？调控Ｓ１ＰＲ２的表达是否逡逑会调节内皮细胞的屏障功能进而影响炎症反应的进程呢？本文旨在探讨影响逡逑Ｓ１ＰＲ２表达的上游调控因素，以较全面了解Ｓ１ＰＲ２在内皮细胞的表达调节。逡逑２５逡逑

转录因子,软件预测,生物信息学软件

一、ＴＮＦ－ａ通过ＬＸＲ／ＲＸＲ实现对Ｓ１ＰＲ２的表达调节逡逑基因表达的调节方式很多，过程复杂，包括转录前的调节，，如表观遗传学逡逑的调节等；转录水平的调节，如转录因子的调节等；转录后水平的调节，如逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ的调节等；翻译水平的调节等等，本研究首先从转录因子的角度研究逡逑Ｓ１ＰＲ２表达的调节。逡逑１．生物信息学软件初步预测转录因子ＬＸＲ／ＲＸＲ可能调控Ｓ１ＰＲ２基因的逡逑表达逡逑由前文可知，ＬＸＲ能够抑制炎性基因的表达，ＬＸＲ必须与ＲＸＲ形成逡逑ＬＸＲ／ＲＸＲ才具有转录因子活性。生物信息学软件预测到ＲＸＲ－ａ在Ｓ１ＰＲ２基因逡逑启动子区有结合位点（见图５），提示ＬＸＲ／ＲＸＲ可能通过ＲＸＲ－ａ与Ｓ１ＰＲ２启逡逑动子区结合并发挥调控作用。我们假设：在静息的ＨＵＶＥＣｓ，ＬＸＲ／ＲＸＲ对Ｓ１ＰＲ２逡逑的表达有抑制作用。ＴＮＦ－ａ诱导ＨＵＶＥＣｓ炎症反应过程中，ＬＸＲ／ＲＸＲ的转录逡逑活性降低，从而在一定程度上解除了其对Ｓ１ＰＲ２表达的抑制，导致Ｓ１ＰＲ２表达逡逑增多，从而减弱内皮细胞的屏障功能。接下来我们将对此进行验证。逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363

【参考文献】