线粒体神经酰胺酶转染K562细胞，通过其下游代谢产物1-磷酸鞘氨醇，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平

发布时间：2020-06-14 21:16

【摘要】： 在20世纪70年代以前，人们认为细胞膜的脂质成分只是一类生化惰性的结构材料。那时，也有部分报道认为脂质成分很可能是重要的信号分子。磷酸肌醇循环的发现以里程碑的形式证明了脂质在细胞信号转导过程中发挥重要作用。在磷脂酶C作用下，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）发生水解，从其脂质骨架中释放出头部基团1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DAG），IP3作用于胞内膜受体，动员细胞内储存Ca2+，而DAG直接结合并且活化蛋白激酶C（PKC），启动各自的信号转导通路。随后又发现，在磷脂酶A2作用下生成的花生四稀酸和磷脂，也是重要的脂类第二信使和细胞内效应调节剂。花生四稀酸作为一种前体物质，生成多种衍生物，每种衍生物都有其特异性的浆膜或细胞内受体，从而引导信号转导方向，产生特异性细胞反应。其它的脂质信号分子还包括磷脂酸（磷脂酶D代谢产物）、溶血磷脂酸、血小板活化因子（PAF）和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3，磷脂酰肌醇-3-激酶的代谢产物），具有激活Akt/PKB、PDK、PKC-ε和PKC-ζ的作用。近年来，又发现膜脂质的另一种组分—鞘脂类也是重要的信号分子。鞘脂类信号分子是鞘脂长链基团衍生物，种类繁多、结构复杂。哺乳动物细胞表面的糖脂成分，就是糖链基团接合膜鞘脂组成的。德国人Tudichum首先采用分散结晶的方法，从脑组织的乙醇提取物中分离出一种天然成分，其分子结构由糖基、脂肪酸和有机质基团三部分组成，并将此种物质命名为‘sphingosine'（鞘氨醇），取词于‘Sphinx’（希腊神话中的狮身人面像）来形容这种物质具有神秘的分子结构。目前，已经鉴定了300余种鞘脂类物质，对其功能、代谢及降解缺陷性疾病进行了详细的探索。特别是Yasuf.A Hannun发现鞘氨醇 WP=5 （鞘脂类代谢产物）具有抑制PKC功能后，鞘脂类作为生物活性分子的认识激发了人们极大的兴趣。除了鞘脂信号过程及代谢途径外，人们还对相关的酶学，拓扑学（指细胞内功能定位）及病理生物化学等内容进行了深入研究。鞘脂代谢物中具有明确生物活性的分子包括鞘氨醇、神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇；此外，鞘糖基磷酸胆碱、鞘氨醇半乳糖苷、乳糖基酰基鞘氨醇和脑苷脂可能也有生物活性。由于神经酰胺在涉及细胞应激反应、衰老及凋亡等多种关键生物学行为的信号通路的调节方面具有重要作用，因此近十年来对神经酰胺的代谢和功能进行了深入研究。神经酰胺酶(Ceramidase, CDase)是参与神经酰胺降解反应的关键酶类。它催化神经酰胺水解，生成鞘氨醇，与神经鞘磷脂酶（Sphingomyelinase, SMase）一起调节细胞内神经酰胺的水平。根据其作用的最适PH值不同，分为酸性、碱性和中性神经酰胺酶。在鞘氨醇激酶（分布于胞浆）的作用下，鞘氨醇迅速代谢为1-磷酸鞘氨醇（SPP）。现在认为，SPP也是一种胞内第二信使，具有动员细胞内储存Ca2+、促进细胞增殖及抑制细胞凋亡等多种作用。目的：最近，又克隆了一种新的神经酰胺酶 (El Bawab S et al. JBC 2000; 275:21508-13)，选择性定位于线粒体。提示线粒体存在着神经酰胺代谢途径，可能对线粒体的功能特别是抗凋亡功能产生影响。我们将线粒体神经酰胺酶基因转染到K562细胞，以此了解线粒体神经酰胺酶细胞生物学效应。方法：1 细胞培养及转染人类慢性粒细胞白血病急变期细胞株K562，培养于含体积分数为10%的灭活胎牛血清（FBS）、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、体积分数为5%的二氧化碳的培养箱中培养，每2～3天传代一次，实验用对数生长期细胞，台盼蓝染色拒染率均在95%以上。含有线粒体神经酰胺酶cDNA序列的pCDNA3.1/His-CDase质粒由美国南卡罗来那医科大学生物化学与分子生物学部Yusuf.A.Hannun教授惠赠。取对数生长期的K562细胞，以无血清的RPMI1640培养基调整细胞密度为2×10~6/ml，取0.5ml接种于6孔平 WP=6 底培养板，加入pCDNA3.1/His-CDase质粒3μg、TfxTM-50脂质体13.5μl及37℃无血清RPMI1640 振荡混匀的乳浊液0.5ml，37℃孵育1h，加入5ml RPMI1640完全培养液（37℃），孵育48h。吸取细胞悬液置25cm2培养瓶（costar）中培养，加入终浓度为800μg/ml的G418筛选转染质粒的阳性细胞株，每3天换液一次，3周后筛选出具有G418抗性的K562细胞，命名为“K562TC”。 2 RT-PCR检测神经酰胺酶（CDase）mRNA表达水平分别离心收集K562TC及K562细胞，以Trizol RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，以M-MLV反转录酶逆转录合成cDNA。CDase扩增条件：94℃ 40s，53℃ 40s，72℃ 1min，扩增35个循环。β2M扩增条件：94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，扩增30个循环。CDase正义引物5’TCACCAGTGGGACCATTGAA3’，CDase反义引物5’CCATGATGAAGGCACGACTG 3’,扩增片段为337bp。β2M正义引物5’ACCCCCACTGAAAAAGATGA3’，β2M反义引物5’ATCTTCAAACCTCCATGATG3’，扩增片段为115bp。取扩增产物，经1.8%的琼脂糖凝胶电泳、EB 染色，紫外灯下观察结果，读胶仪（AlphaImageTM 1220 Documentation Analysis System, Alpha Innotec Corperation , USA）扫描读取各条产物带的光密度值，以CDase/β2M的比值作为CDase的相对表达
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R341
【图文】：

代谢途径,鞘磷脂,神经酰胺

以神经酰胺为中心的鞘磷脂代谢途径

鞘磷脂,细胞定位

鞘磷脂代谢的细胞定位

【参考文献】