慢性持续性乙肝病毒感染表位特异性CTL的功能研究

发布时间：2020-06-17 12:34

【摘要】：尽管预防性乙肝病毒(1aepatitis B virus,HBV)疫苗已经在全球广泛应用,慢性持续性感染仍然是重要的健康问题。目前全世界慢性HBV感染已经超过3.6亿人,乙肝相关的肝硬化和肝癌的死亡率正逐年增加。因此,明确:HBV感染的慢性化机制,设计更为有效的治疗性疫苗是当前刻不容缓的问题。 HBV病毒作为嗜肝的DNA病毒,本身对肝细胞并没有损害。MHC—I类分子限制性的CD8 T细胞即细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在清除胞内乙肝病毒和肝细胞的损伤中均起关键作用。CTL通过对病毒相关抗原表位的识别、活化,经穿孔素/颗粒酶依赖的途径杀伤靶细胞,或通过Fas/FasL 途径启动靶细胞的凋亡;以及通过细胞因子释放的非细胞毒途径如IFN.Y等抑制病毒的复制。近年来研究发现细胞因子释放的非细胞毒途径在清除HBV中可能起更为重要的作用,使传统的细胞毒途径占主导地位的学说受到了挑战。现代技术的发展尤其是MHC-I类分子限制性表位肽/四聚体复合物(Tetrameric complex)即tetramer技术的产生,可以将表位特异性的CTL进行精确定量,为我们探讨CTL 与肝损害及控制病毒复制之间的关系提供了可能性。 Fetramer技术结合胞内因子染色和表型分子的检测,近年来使人们对CTL 的认识迅速达到单个细胞水平,并从T细胞分化的角度对慢性持续性病毒感染的发生机制有了全新的认识。目前T细胞分化有两种模式:(1)基于CCR7等归巢到淋巴组织相关受体分子的表达,分中心性记忆细胞(central memory T cell,’rcM)和效应性记忆细胞(effector memory T cell,TEM)。TcM表达CCR7,缺乏迅速反应的效应功能,但能对细胞因子或病原进行快速的反应并成熟为TEM,失去CCR7的表达,获得组织归巢受体,并大量分泌细胞因子。 (2)基于共刺激分子CD27和CD28的表达,结合CD45RA, 将是否表达CD27、CD28划分为早期、中期及晚期分化状态。表现为初始型 (CD45RA CD27 CD28 )、记忆型(CD45RA—CD27 CD28 )、效应型(CD45RA ’本项目受国家重点撼础研究发展规划项目(973计划)一抗原结构特征与免疫应答的关系(No.2001CB510001)、国家自然科学基金重人项目一基于表位免疫识别结构信息研(No。llllIIlI)的资助。 WP=13 CD27一CD28”)。CD27的早、中期细胞群具有高增殖能力,低细胞毒活性;高分化的 CD27“细胞群具有强有力的效应功能,高表达具有直接杀伤效应的穿孔素、Granzymes 等,增殖能力低。细胞分化表型的认识对病毒感染慢性化机制及疫苗设计策略有了全新的启示。新近将T细胞分化的观点引入对HIV感染T细胞表型的研究,发现免疫控制作用失败的原因是CTL效应细胞的分化成熟障碍。无论是表位特异性的CD4 T细胞还是 CD8 T细胞,与CMV病毒特异性T细胞相比,都表现为一种CD27 的“中间分化”的不成熟状态,这些延迟分化的表型表现为穿孔素和IFN-v分泌的降低,病毒由此可以逃避清除而进行持续复制状态。这种现象不仅表现在HIV感染中,还出现在 Epstein-Barr病毒感染及其它病毒感染和肿瘤生长中。由此认为,抗原特异性T细胞的分化成熟障碍可能是解释CTL 失控的关键因素。基于上述研究结果,我们推测在慢性HBV感染患者体内,CTL免疫控制能力的丧失也可能由T细胞分化成熟障碍造成。为此本研究首先从量的角度对慢性乙肝患者体内表位特异性的CTL进行了定量研究,随后从质的角度对表位特异性的CTL 进行了功能检测,并对这些CTL进行了表型分析。本实验选取四个在急性感染时具有代表性的优势性表位,即针对HBV核心抗原 core 18—27,被膜抗原enV 183-19l、env 335-343以及聚合酶pol 575-583的PE-tetramer‘ 试剂,结合PE.-Cy5标记的CD8单克隆抗体,采用流式细胞仪荧光激活细胞分类术双标染色的方法,通过全血法和分离肝浸润淋巴细胞的方法对慢性HBV感染患者体内 CTL进行直接离体的准确定量,结合肝损害的标志转氨酶水平、病毒载量,采用多元逐步回归分析(multiple stepwise regression analysis)的方法,从科学统计的角度达到对不同表位特异性CTL的宏观断面分析。在功能检测中,本研究首先通过固相化学合成法合成了core 18—27、env 183—19l、 env 335-343和pol 575.583四个表位肽,选择了具有代表意义的细胞毒效应分子穿孔素和细胞因子IFN-Y。通过PE标记的tetramer、PE-Cy5标记的CD8单克隆抗体、FITC 标记的穿孔素和IFN-Y的单克隆抗体,进行流式细胞仪荧光激活细胞分类术三色荧光标记的直接离体分析和体外肽扩增实验。同时选用FITC标记的表型标志CCR7、CD27 和CD28的单克隆抗体,通过流式细胞仪三色荧光标记的方法进行了表型的分析。结果发现,慢性活动性乙肝患者体内仍可检测出多克隆的CTL反应,肝脏浸润的淋巴细胞中表位特异性的CTL 比外周血的数量要多。表明在慢性HBV感染体内,表位特异性的CTL并未克隆清除。但这些表位特异性的CTI.,与病毒载量和转氨酶水平 WP=14 都没有显著相关性(P0.05)。提示慢性乙肝患者体内存在的CTL可能并不直接造成肝细胞的损害;表位特异性的CTL数量并不能代表机体的保护性免疫状态。单纯从CTL数量检测的角度无法解释体内转氨酶水平升高的原因。进一步通过效应分子检测的功能实验,
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：

细胞的,流式细胞仪分析,目标

图 1-1：流式细胞仪分析时目标细胞的设门左图 R1 为全血法淋巴细胞的划门，右图 R2 为 CD8high细胞的划门Figure 1-1 The gates of aimed cells on the anaysis by FACSscan plots show lymphocytyes obtained from whole blood after red cell lysed (left,RDot plots show CD8highcells obtained from lymphocytyes(right,R2)

流式细胞仪分析,细胞的,目标

图 1-1：流式细胞仪分析时目标细胞的设门左图 R1 为全血法淋巴细胞的划门，右图 R2 为 CD8high细胞的划门Figure 1-1 The gates of aimed cells on the anaysis by FACSscanot plots show lymphocytyes obtained from whole blood after red cell lysed (left,Dot plots show CD8highcells obtained from lymphocytyes(right,R2)

【参考文献】