组织工程化人工松果体-大鼠松果体细胞微囊的实验研究

发布时间：2020-06-18 06:55

【摘要】： 当今社会，人口老龄化已成为社会问题，老年医学及抗衰老研究倍受推崇，寻求行之有效的抗衰老措施、提高生存质量成为当务之急。近年的研究证实，作为神经内分泌器官的松果体，其分泌的多肽及吲哚激素，尤其是褪黑素(melatonin，MT)除参与生殖反应、炎症免疫反应、疼痛、睡眠等机体调节作用外，尚有显著的自由基清除性抗衰老功效，因而外源性MT的摄入已成为治疗老年性疾病的手段之一，但目前运用的外源性MT临床疗效远不近人意，其毒副作用尚缺乏明确的统计及检测。采用组织工程技术体外构建松果体组织并植入体内，发挥其分泌功能，替代因松果体钙化性MT和其他多肽激素的血浆低浓度及由此引发的一系列衰老过程，同时避免应用外源性MT的单一疗效及其毒副作用，应不失为一种有前景的抗衰老手段。本课题从这一目标入手，进行了松果体细胞的体外培养、微囊包裹研究，探讨松果体细胞微囊移植对MT低血浆浓度的改善情况，为采用组织工程技术对抗衰老提供基本的实验和技术手段。材料和方法 (1)．采用胶原酶、胰酶两步消化法获取分散的SD乳鼠松果体细胞悬液，接种、培养，相差显微镜观察细胞贴壁、生长及其形态、结构特点，建立松果体细胞体外培养体系。 (2)．采用MTT法、BrdU掺入、5-HT免疫细胞化学法，HPLC、透射电镜、RT-PCR等技术分析松果体细胞在体外不同培养时间段的增殖、分化及功能表达，分析松果体细胞的生物学特性，探寻松果体细胞体外扩增与功能分化的最佳时机。 (3)．采用共轴气流喷射技术，alginate-poly-l-lysine-alginate(APA)微囊包裹松果体细胞，体外培养，分析松果体细胞微囊的生物学特性、免疫隔离效应及囊内细胞的功能状态。 (4).分别采用体外培养及直接消化分离的松果体细胞进行微囊化处理，分析比较不同来源松果体微囊的功能差异，筛选耐受性、适应性、活性良好的种子细胞用于微囊移植研究。 (5).制备去松果体大鼠模型，检测术后MT血浆浓度的动态变化，评价并明确松果体微囊移植的最佳时机。 (6).进行松果体细胞微囊的移植实验，‘探讨回收微囊及囊内细胞的形态、结构变化，动态分析移植组与对照组以及不同移植时间的MT变化情况，评价松果体细胞微囊在体内的功能发挥、免疫屏蔽及其生物相容性。结果 (1).两步消化分离及普通的体外培养条件下(DMEM一F12，含 10%FBS)，松果体细胞贴壁、生长旺盛，原代细胞的良好生存状态可达6Od。 (2).细胞学鉴定确认90%的培养细胞为松果体细胞，细胞的生长倍增时间为第gd，第lld达高峰;松果体细胞的体外功能状态呈逐渐恢复趋势，MT的分泌量于第2周开始增加，第3 周达高峰，随后缓慢下降。培养细胞具备功能活跃细胞的超微结构特征，一月龄原代细胞仍明显可见胞质分泌颗粒，凝胶电泳检测证实培养细胞MT合成限速酶NAT的表达如常。 (3).气流喷射法(l .SBar气压)获得直径400一700um的圆形APA 松果体细胞微囊，囊内细胞存活良好，释放后仍能迅速贴壁生长，HPLC检测证实微囊化松果体细胞MT分泌功能旺盛，对肾上腺素能激动剂作用敏感:淋巴细胞转化实验明确了松果体微囊的免疫隔离效应。 (4).直接消化分离获取种子细胞操作简便，但体外培养的松果体细胞与微囊材料有更好的组织相容性和分泌活性，宜选择培养后包裹的松果体微囊进行移植研究。 (5).大鼠行松果体摘除后血浆MT水平迅速下降，术后第3d末降至正常血浓度的1/2，15d后夜间血浆MT值难以检测。 (6).松果体微囊及对照组(非微囊松果体细胞悬液)移植术后24h 均可检测到MT，并出现昼低夜高节律的部分恢复现象。15 (l) (2) (3) (4) (5) d后对照组的MT值难以检测，而松果体微囊移植鼠的平均 MT值阳性时间较对照组明显延长，能维持平稳的分泌功能约2周，随后缓慢下降，1月时仅测得微量的MT，45d后微囊及对照组的血MT值检测均为阴性。结论常规消化及普通体外培养条件下，大鼠松果体细胞贴壁、生长状态良好，确保了体外操作以及筛选活力、生长、功能稳定的种子细胞的可行性。 1一7d龄乳鼠松果体原代细胞体外增殖、生长能力旺盛，功能表达于培养第1周末开始恢复，第2一3周间最为活跃，可作为微囊包裹的最佳时间段。喷射法能获得完整的APA松果体细胞微囊，所得微囊形态、直径及包含的细胞数量基本符合实验要求，囊内细胞的活性及功能在一定时间内能保持生理状态，微囊具备良好的免疫隔离效应和生物相容性。囊内细胞于包裹24h后即有分泌功能，可立刻进行移植实验。松果体完全摘除后动物呈现长期的MT低血浆浓度，是研究松果体激素效应的理想模型。建议术后15d为较佳的移植及实验时1’日」。松果体细胞微囊移植在短期内能有效提高异品系模型动物的血浆MT水平，同时部分恢复其生理性昼夜节律，说明APA 松果体微囊具备良好的免疫保护效应及生物相容性，采
【学位授予单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R329
【图文】：

松果体,大鼠,胰酶消化,血清中和

无菌条件下剥离颅骨，游离松果体并置于冷D一hank’S液中，显微解剖镜下彻底剥除外膜及血管(图1).置冷D一hank’S液洗涤并剪碎，0.10，0胶原酶消化Zomin、0.250，0胰酶消化lomin后，血清中和，反复吹打，离心弃上清，用含10%小牛血清的DMEM培养基反复吹打，制成细胞悬液，按1x105/ml的细胞密度接种于25ml培养瓶，静置培养。将培养1周的部分细胞胰酶消化

松果体细胞,体外研究,松果体

图4.培养2周后旺盛生长的松果体细胞(x100)(四)讨论一砂松果体细胞的分离和培养是体外研究构建。哺乳动物松果体体外培养早在70年代已有报道织[30]及细胞13‘、32]的培养技术。为了寻求能良好研究体系，国外学者多致力于松果体的细胞

【参考文献】