单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白加趋化因子MIP-1α核酸疫苗的构建及初步免疫观察

发布时间：2020-06-18 11:56

【摘要】：单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)主要引起生殖器疱疹。近年来，生殖器疱疹的发病率在迅速上升，危害性亦日益显得突出，但目前尚无特效药控制其发生和复发，因此研制疱疹病毒疫苗已成为预防生殖器疱疹感染的关键。在现已研制的疫苗中，DNA疫苗尽管诱导的免疫应答效力较低，可因其具有制备简单、安全、诱导的免疫应答广泛长久，并且可以共表达免疫调节因子，根据需要诱导产生最适免疫应答等特性，受到人们的青睐。近几年来，国外学者们一直在探索应用分子佐剂来加强DNA疫苗的免疫效果，并取得了一定的成效。为构建有效预防HSV-Ⅱ的DNA疫苗，探讨分子佐剂对DNA疫苗的作用机制，本研究完成了以下工作： 1．HSV-Ⅱ gD DNA疫苗的构建：根据GenBank中HSV-Ⅱ HG52株gD基因序列设计了一对引物，采用PCR方法扩增出HSV-Ⅱ Sav株gD全部编码区的基因片段，经中介pUCm-T载体，将其插入到真核表达质粒pcDNA3中相应的位点，并转化E．coli DH5α，构建出HSV-Ⅱ gD DNA疫苗。通过PCR、酶切和测序鉴定，证明gD基因片段在pcDNA3中插入正确，并将构建出的重组质粒命名为Pg。经原位ELISA法证实，Pg在COS-7细胞中瞬时表达的蛋白能够与gD单克隆抗体结合，这表明所构建的Pg DNA疫苗能够在哺乳动物细胞中表达。 2．小鼠趋化因子MIP-1α重组真核表达质粒的构建：首先用细菌脂多糖天津医科大学博士研究生学位论文 (LPS)刺激RAW264.7细胞，提取总RNA，然后应用RT一PCR方法，扩增出MIP一1 。基因的全部编码序列。经中介pucm一T载体和Hindln、Xbal双酶切处理后，将其插入到用相同酶切的真核表达质粒peDNA3中，并转化E.coh DHS“。通过PCR、酶切和测序鉴定，证明MIP一la基因片段在PcDNA3中插入正确，并将构建出的重组质粒命名为Pm。经RT一PCR和Boyden趋化小室法鉴定，证实了所构建的Pm在哺乳动物细胞中能够表达具有生物学活性的MIP一1。。 3.pg+pm DNA疫苗对小鼠的初步免疫观察:每次用200林g/200林1 peDNA3、 Pg、Pg十Pm和等体积生理盐水(NS)肌肉注射免疫BALB/C小鼠，连续免疫3 次，末次免疫后一个月用IOOLDS。病毒量进行阴道内攻击。结果表明Pg+Pm疫苗组的存活率(86.7%)明显高于Pg疫苗组的(53.3%);通过阴道组织病理切片和半定量积分分析，证明了Pg+Pm疫苗比Pg疫苗明显降低了小鼠的发病率。为探讨Pg+Pm DNA疫苗诱导的免疫应答，于末次免疫后第二周及第四周收集小鼠血清和脾细胞，采用微量细胞中和试验和EL工SA法检测血清特异性抗体，采用淋巴细胞转化试验检测脾T细胞增殖反应程度。结果显示Pg+Pm DNA 疫苗没有比Pg DNA疫苗诱导出更高的特异性抗体，但脾T细胞增值反应程度明显高于Pg疫苗组的，表明Pg+Pm DNA疫苗诱导了更高的细胞免疫应答。综上所述，本研究以HSv一H gD和M护一1。成功构建了预防HSv一H感染的DNA疫苗。动物初步免疫发现，gD加MIP一1。的DNA疫苗免疫效应优于单独的gD DNA疫苗，可以显著地提高小鼠的保护率和降低发病率。提示以 MIP一1。作为分子佐剂的HSV一H DNA疫苗具有潜在的应用价值。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：

产物,琼脂糖凝胶电泳,平板筛,回收纯化

Hsv一IlgnPeR产物琼脂糖凝胶arkerDL2000:2000，1000，751gDPCR产物segeleleetroPhoresisofHSV一IlgDrkerDL2000:2000，1000，75gDPCRProduet体的构建与鉴定:物经回收纯化后，插入pUC青霉素平板筛选后，PCR、酶

酶切鉴定

2Hsv一ngD基因克隆载体的PcR、酶切鉴4Idigest:19329，7743，6223，4254，3472，2690，;T/gD经Hindlll酶切:T/gD经Hind川酶切;T/gD经xbal酶切;gD经xbal酶切。etionendonueleasesanalysisofthereeombinantIdigest:19329，7743，6223，4254，3472，2690，uet:endonueleasesanalysisofPUCm一T/gDinse

【参考文献】