MicroRNA-21在高糖诱导血管内皮细胞凋亡中的表达及功能

发布时间：2020-06-18 15:36

【摘要】： 背景 目前研究认为，microRNAs(miRNAs)广泛参与了机体多种生理、病理过程的调控，miRNAs已成为生命科学研究领域的热点。MicroRNA-21(MiRNA-21)作为一种具有显著抗癌细胞凋亡作用的特殊miRNA，在肿瘤领域尤其引人关注。MiRNA-21通过对其重要靶基因程序化细胞死亡分子4(PDCD4)的调节是miRNA-21发挥抗癌细胞凋亡作用的重要机制之一。近年发现miRNA-21在血管平滑肌细胞和心肌细胞中也存在miRNA-21的表达。MiRNA-21通过调节PDCD4的表达参与了血管平滑肌细胞和心肌细胞的凋亡、增殖及对抗氧化应激引起的细胞损伤等重要过程，提示miRNA-21及其靶基因PDCD4可能在心血管领域具有重要的生物学作用。但miRNA-21在血管内皮中的表达、调节和功能目前尚不清楚。糖尿病状态下高浓度葡萄糖引起血管内皮细胞凋亡增加和细胞功能受损，导致内皮屏障破坏被认为是糖尿病诱发动脉粥样硬化发生、发展的重要环节。MiRNA-21的表达调节是否参与了糖尿病状态下血管内皮细胞的凋亡损伤过程目前未见相关研究报道。 目的 研究miRNA-21在高浓度葡萄糖作用下血管内皮细胞中的表达变化情况，探讨miRNA-21是否通过调节PDCD4的表达参与了高糖诱导的血管内皮细胞凋亡损害过程。 方法 (1)用不同浓度D一葡萄糖(5．5mM、11mM、22mM及33 mM)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVECs)48小时。实时定量RT-PCR方法检测细胞中miRNA-21表达和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表达情况；用Western blot方法检测PDCD4、Bax及Bcl-2蛋白在细胞中的表达变化；用分光光度计法检测HUVECs中的Caspase-3的活性变化；Hoechst33342／PI双荧光染色观察细胞凋亡；MTT法检测不同浓度葡萄糖作用下HUVECs的增殖情况。 (2)HUVECs中miRNA-21干扰抑制实验： 用脂质体Lipofectamine~(TM) 2000将不同浓度的miRNA-21抑制剂2’OMe-miRNA-21(分别为3nM、10 nM、30 nM及100 nM)转染到低血清OPTI-MEM培养基孵育的HUVECs中，5h后换含33mM葡萄糖DMEM完全培养液，继续培养48小时。实时定量RT-PCR方法检测miPNA-21干扰抑制48小时后HUVECs中miRNA-21表达和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表达情况；Western bolt法检测PDCD4、Bcl-2及Bax的蛋白表达水平；用分光光度计法检测HUVECs中的Caspase-3的活性变化；Hoechst33342／PI双荧光染色观察细胞凋亡；MTT法检测HUVECs的增殖情况。 (3)HUVECs中miRNA-21过表达实验： 用脂质体Lipofectamine~(TM) 2000将10nM和30hM的miRNA-21模拟物转染到低血清OPTI-MEM I培养基孵育的HUVEECs中，5h后换含5．5mM或33mM葡萄糖的DMEM完全培养基，继续培养48小时。实时定量RT-PCR方法检miRNA-21过表达48小时后HUVECs中miRNA-21表达和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表达情况；Westernbolt法检测PDCD4、Bcl-2及Bax的蛋白表达水平；用分光光度计法检测HUVECs中的Caspase-3的活性变化；Hoechst33342／PI双荧光染色观察细胞凋亡；MTT法检测HUVECs的增殖情况。 结果 (1)随着葡萄糖浓度(5．5mM、11mM、22mM及33 mM)的增加，HUVECs中miRNA-21的表达水平呈浓度依赖性降低(p0．01)，PDCD4的蛋白表达水平增加(p0．05)，但对PDCD4的mRNA表达无影响(p0．05)：高浓度葡萄糖呈浓度依赖性下调HOVECs中Bcl一2的mRNA及蛋白表达水平(p0．05)，同时上调Bax的ⅢRNA及蛋白表达(p0．05)，Bax／Bcl-2的mRNA和蛋白表达比值也明显增加(p0．01)；高浓度葡萄糖呈浓度依赖性升高Caspase-3的mRNA表达和Caspase-3活性水平(p0．05)，细胞凋亡增加(p0．05)，同时降低细胞增殖活性水平(p0．05)。 (2)10nM、30nM及100nM／的2’OMe-miRNA-21呈浓度依赖性明显降低33nM葡萄糖孵育的HUVECs中miRNA-21的表达(P0．01)，明显上调PDCD4的蛋白表达水平(p0．01)，而不同浓度miRNA-21抑制物对33mM葡萄糖孵育的HUVECs中PDCD4的mP,NA表达无影响(p0．05)。 (3)10nM、30nM及100nM的2’OMe-miRNA-21呈浓度依赖性降低33mM葡萄糖孵育的HUVECs中Bcl-2的mRNA及蛋白表达(p0．05)；显著增加Bax的mRNA及蛋白表达(p0．01)，Bax／Bci-2的mRNA及蛋白表达比值明显升高(p0．01)。显著升高Caspase-3的mP,NA表达和Caspasel3活性(p0．01)，细胞凋亡明显增加(p0．01)，同时降低细胞增殖水平(p0．05)。 (4)10nM和30nM的miRNA-21模拟物均明显增加5．5mM或33mM葡萄糖孵育下HUVECs中miRNA-21表达水平(p0．01)，显著降低PDCD4的蛋白表达(p0．01)，但对不影响PDCD4的mRNA表达水平(p0．05)。相同剂量的miRNA-21模拟物引起33mM葡萄糖孵育下HUVECs中miP,NA-21及PDCD4蛋白表达的变化程度强于5．5mM葡萄糖孵育下HUVECs中相关指标的变化(p0．05)。 (5)30nM的miRNA-21模拟物明显上调5．5mM和33mM葡萄糖孵育下HUVECs中Bcl-2的mP,NA及蛋白表达水平(p0．01)，同时下调Bax的mRNA及蛋白表达(p0．01)，Bax／Bel-2的mRNA和蛋白表达比值显著降低(p0．01)。细胞中Caspase-3的mP,NA表达和Caspase-3的活性水平明显减少(p0．01)。细胞凋亡数明显减少(p0．01)，而细胞增殖活性增加(p0．05)。30nM的miRNA-21模拟物对33mM葡萄糖孵育下HUVECs中Bax／Bcl-2的mIWA和蛋白表达比值、Caspase-3的mP,NA表达、Caspase-3的活性、凋亡细胞数及细胞增殖活性水平的变化程度影响均低于5．5mM葡萄糖孵育下HUVECs中相关指标的变化(p0．05)。 结论 (1)高浓度葡萄糖可降低血管内皮细胞中miP,NA-21表达水平，同时增加PDCD4的蛋白表达。MiP,NA-21通过转录后抑制的方式调节PDCD4的表达，PDCD4是血管内皮细胞中miRNA-21的重要作用靶基因。 (2)MiP,NA-21通过调节PDCD4表达参与了高糖诱导的血管内皮细胞的凋亡过程，并影响细胞的增殖。 (3)MiRNA-21在血管内皮细胞中的表达变化可影响Bax／Bcl-2系统在细胞内的平衡，miRNA-2l与Bax／Bcl-2体系可能共同参与了高糖诱导的血管内皮细胞凋亡过程。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363
【图文】：

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本文编号：2719471