登革病毒prM-E基因的多价重组质粒DNA的免疫原性研究

发布时间：2020-06-19 11:31

【摘要】：登革病毒是黄病毒科的重要成员，包括四个血清型，其每个血清型均可使人发病，症状从较轻微的DF，到较为严重的DHF／DSS。近年来，随着全球气候变暖和国际交往的日益频繁，DF和DHF／DSS的发病率迅速上升。目前，DF／DHF已成为热带和亚热带地区最为严重的公共卫生问题。到目前为止，仍没有安全有效的登革疫苗用于临床。传统的减毒活疫苗已进行多年的临床试验，人们也一度认为该疫苗是最有希望进入临床使用的疫苗，但最近大量的临床数据表明，四价减毒活疫苗不足以同时提供针对四个血清型的保护性应答反应。因此，登革新型疫苗的研究极为迫切和重要。 DNA疫苗是90年代出现的一种新的疫苗形式。该疫苗与传统疫苗相比，可同时诱导体液和细胞免疫应答、并具有制备简单、无毒力回复、可联合接种等优势。目前该技术已用于构建JEV、HIV、流感、乙型肝炎和HSV等的疫苗侯选株。将含有登革病毒prM、E或NS1等抗原基因的质粒DNA免疫小鼠和猴，也可使动物产生体液和细胞免疫应答，并使动物免受病毒攻击。双顺反子表达载体含有核糖体内部进入位点，因此可同时表达两种不同的抗原。将含有乙型肝炎表面抗原和核心抗原的双顺反子表达载体免疫小鼠，小鼠可同时产生针对这两种抗原的免疫应答。这为双价及多价DNA疫苗的研制奠定了基础。基于以上考虑，本研究利用双顺反子表达载体pIRES构建含登革病毒prM-E基因的双价和四价重组质粒DNA，并在小鼠中观察其免疫原性，为登革多价DNA疫苗的研究提供依据。首先，我们构建了含登革1和3型病毒prM-E基因的双顺反子重组质粒DNA。利用Trizol试剂从感染DEN1和DEN3的乳鼠脑中提取病毒RNA，然后分别进行RT-PCR，得到DEN1和DEN3 prM-E基因。先将DEN3 prM-E基因插入pIRES载体IRES序列的下游，再将DEN1 prM-E基因插入IRES序列的上游，获得双顺反子表达载体pME1-IRES-ME3。为了证明所构建的重组质粒DNA在真核细胞中可表达登革病毒的prM-E蛋白，将pME1-IRES-ME3以电穿孔的方法转染BHK21细胞，结果表明，在转染后24小时，通过RT-PCR在胞内可检测到登革病毒的特异核酸片段，通过间接免疫荧光法在细胞的胞浆中可检测到登革1和3型病毒所特异的蛋白。利用同样的方法构建了含DEN2和DEN4 prM-E基因的重组质粒pME2-IRES-ME4。含DEN1～4型病毒prM-E基因的两个双价重组质粒的构建为在小鼠中观察其免疫原性中文摘要奠定了基础。为提高质粒DNA的免疫原性，我们将含鼠源GM一CSF的质粒 pUMCVI一mGM一CSF与pMEI一IRES一ME3和pMEZ一IRES一ME4进行联合免疫。接种途径采用肌肉多点注射，并在注射后立即对注射部位进行电刺激，以提高DNA的摄入效率。结果发现，重组质粒DNA免疫的小鼠在初次免疫后第4周即可检测到登革病毒的特异抗体(荧光效价为1:5)，随着时间的延长，抗体效价逐渐上升，至初次免疫后第14周，抗体效价达到最高(均为1:160)。对初次免疫后第14周的小鼠血清测定中和抗体，结果表明，重组质粒DNA免疫的小鼠血清中和抗体效价达卜32，而空载体PIREs免疫的小鼠则均小于1:8。从荧光抗体和中和抗体水平来看， GM一CSF在不同时间对体液应答水平均有促进作用。为观察免疫小鼠的细胞免疫应答水平，我们于初次免疫后第47天和62天制备小鼠的脾细胞悬液，在体外用登革 1一4型灭活病毒抗原进行刺激，4天后测定脾细胞的增殖能力(MTT法和MTS法) 及其分泌工FN邓的水平。结果显示，重组质粒DNA免疫组小鼠脾细胞分泌的工FN寺水平和脾细胞的刺激指数均明显高于对照组，但GM一CSF对细胞免疫应答的促进作用不明显。另外，重组质粒DNA对小鼠脾细胞中的cD4+、cDS+丁细胞种群比例没有影响。通过对免疫小鼠注射部位的肌肉进行H巨染色，显示GM一CSF可提高炎症细胞向注射部位侵润的能力。总之，我们所构建的含DENI和DEN3 PrM一E基因、DENZ 和DEN4 PrM一E基因的两个双价重组质粒DNA在小鼠中均可产生针对相应血清型的特异抗体和细胞免疫应答，两个双价重组质粒DNA经配伍成四价质粒DNA后，在小鼠中同样可产生针对四个血清型的免疫应答。GM一CSF对体液免疫应答有促进作用，但对细胞免疫应答无明显的促进作用。为进一步提高重组质粒DNA的免疫原性，拟利用重组的病毒蛋白对小鼠进行加强免疫，以提高中和抗体水平及其持续的时间。为此，在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白的B区(298一400氨基酸)进行了表达。我们采用pBAD/Topo ThioF。Sion原核表达载体，结果显示，表达产物以可溶性为主，并且表达量约占细菌可溶性总蛋白的62%。通过免疫印迹和EL工SA检测表明，表达产物可与登革2型病毒的特异抗体反应，而与登革病毒其它血清型多抗无交叉反应。包膜蛋白B区的表达也为研制登革病毒的亚单位疫苗奠定了基础。除了利用双顺反子载体构建登革多价疫苗外，本研究还尝试利用DNA改组技术构建登革病毒的四价疫苗。由于DENI一4病毒包膜基因的同源性只有60%左右，这给DNA改组带来了极大的困难。我们先后采用了多种方法，如家族DNA改组中文摘要 (几mily DNA shuming)、暂时模板上的随机嵌合(random ehineragenesis on transient templates，RACHITT)
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：

E基因,质粒DNA

DENI和D阳3PrM一E基因的R…I}pCRAmPlifieationofPrM一EgenesofDENIan:DNAmoleeularmarkers(DL15000)andZ:amPlifiedProduetsofPrM一EgenesofDENbyRT-PCR，resPectively组质粒DNA的构建EN3PrM一E基因的RT-PcR扩增产物纯中。考虑到DENIPrM一E基因含有Xbal载体PIRES的IRES序列下游(阳性克一E基因插入PIRES一ME3质粒DNA的IS一ME3)。含DENI和DEN3PrM一E基2。

双顺反子,重组质粒,条带,重组质粒DNA

FigZConstructionProeeduresofthebicistroniereeombinantPlasmidDNA双顺反子重组质粒DNA采用PCR和酶切法进行鉴定。以DIABF和DIABR、D3ABF和D3ABR为引物进行PCR扩增，均可得到约2kb的特异条带(见图3的泳道4和5)，Mtu工和Nhel也可从质粒上切下一条约Zkb的条带(见图3的泳道3)，而Xbal的酶切结果也均与预期(约7.skb、1.4kb、0.skb)一致(见图3的

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