中脑导水管周围灰质HCN通道参与大鼠神经病理性痛的机制研究

发布时间：2020-06-22 16:44

【摘要】：神经病理性痛是一种影响人类健康的顽疾，长期困扰患者并严重影响其生活质量，其对于健康的危害程度不亚于肿瘤。在痛觉信息传递过程中，中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)是中枢下行痛觉调制系统的关键结构，其中中脑导水管周围灰质腹外侧区(ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG)是机体对伤害性信息进行自身调制或整合的重要位点，它可被发自脊髓和延髓的第二级感受伤害性刺激的神经元激活，将伤害性信息投射至更高级中枢，进而对伤害性信息进行处理。同时，vlPAG也发出纤维加入下行调制系统，参与对延髓和脊髓背角内上行性伤害性信息传递的调控。因此，研究vlPAG脑区参与疼痛调控的作用机制，有助于了解神经病理性疼痛发生和维持的机制。以往研究表明，分布在外周及脊髓背角的超极化激活-环核苷酸门控的阳离子通道（hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated cation channels，即“HCN通道”）的异常活化引起的神经元异位放电是神经病理性痛产生和持续的重要因素，部分结果提示HCN通道阻断剂可能通过抑制脊髓以上的中枢发挥镇痛作用。vlPAG脑区可见HCN1和HCN2通道表达分布，但目前对于vlPAG脑区HCN通道参与神经病理性痛的发病机制尚需深入探讨。 HCN通道家族成员是上世纪90年代被克隆出，该家族由HCN1、2、3和4四个亚型组成，广泛分布在心血管和神经系统，其电生理功能的多样性一直吸引着众多研究者的目光。HCN通道最主要的特性就是通过调控神经元细胞膜生物学特性影响神经元的兴奋性及突触信息传递。研究表明，HCN通道是调控心血管及神经系统稳定的重要因素，在一系列以神经系统兴奋性异常改变为特点的疾病（如癫痫、脑缺血及神经病理性痛的研究）中，均检测到HCN通道功能发生异常改变。目前认为HCN通道，特别是HCN2通道在炎性痛和病理性痛中表达升高，激活速度加快，促进外周异位放电的形成；敲除HCN2基因之后能够明显抑制异位放电及缓解疼痛症状，且不影响动物的正常感觉及痛阈。这提示HCN通道异常改变在神经病理性痛的起始及维持中发挥重要作用，同时也提示cAMP信号途径在病理性痛发生及维持中发挥很重要的作用，但迄今为止对于vlAPG区HCN通道在神经病理性痛发病中的作用尚缺乏研究。我们推测在神经病理性痛过程中vlPAG脑区HCN通道可能出现表达、功能变化，使某些类型神经元电活动发生改变，进而参与或者诱导了病理性痛相关疾病症状的发生及维持。本课题拟通过坐骨神经CCI (chronic constriction injury)手术制备神经病理性痛动物模型，运用形态学、电生理以及行为学技术，研究vlPAG脑区HCN通道在神经病理性痛调控中的作用；通过在体行为学及离体电生理实验，研究HCN通道抑制剂参与镇痛的具体分子及电生理机制；并以cAMP信号途径为切入点，初步探讨病理性痛过程中vlPAG脑区HCN通道功能改变的调控机制，为治疗神经病理性疼痛提供深入的理论基础。方法： 1.通过坐骨神经CCI手术制备大鼠神经病理性痛模型，并通过实时定量PCR、免疫组织化学染色和Western blot定量观察vlPAG脑区CCI术后HCN1和HCN2通道mRNA水平和蛋白的表达及分布改变； 2.制备vlPAG脑内置管后的CCI大鼠模型，注射HCN通道阻断剂后，通过热辐射法和Von Frey(vFh)纤维丝检测大鼠热痛阈和机械性痛阈的变化； 3.脑片全细胞膜片钳技术观察记录正常及CCI组脑组织片vlPAG脑区神经元的HCN通道电流及神经兴奋性的变化情况。通过Biocytin标记对脑组织片vlPAG脑区记录细胞进行形态学鉴定。 4.应用“胞内cAMP检测试剂盒”检测正常及CCI组vlPAG脑区组织胞内cAMP水平的差异，全细胞膜片钳技术观察记录脑组织片vlPAG脑区神经元在分别给予AC激动剂FSK和HCN通道抑制剂后神经元兴奋性的变化。结果： 1．成功制备了大鼠坐骨神经CCI神经病理性痛的动物模型，CCI术后大鼠热痛阈和机械性痛阈均显著降低，术后14d最明显，假手术组大鼠痛阈未见明显变化。CCI组大鼠的运动功能未受影响，与假手术组和正常组大鼠相比较无显著差异。 2．实时定量PCR结果显示大鼠CCI术后14d，其vlPAG脑区HCN1和HCN2通道mRNA水平均显著上调；免疫组织化学和Western blot结果显示大鼠CCI术后14d，vlPAG脑区HCN1通道和HCN2通道蛋白表达显著增加，神经元胞膜表达显著升高，且阳性神经元比例显著升高。 3. vlPAG脑区微量注射生理盐水后CCI大鼠的热痛阈和机械性痛阈均未发生明显变化；给予ZD7288后的CCI大鼠其损伤同侧后肢热痛阈和机械性痛阈明显升高，且差异具有统计学意义，HCN通道阻断剂ZD7288的镇痛效应具有剂量依赖性和时间依赖性，剂量越高效果越明显，且效果虽注射后时间迅速升高，而后逐渐降低。vlPAG脑区注射生理盐水或ZD7288对正常及模型动物的运动功能无显著影响。 4.全细胞膜片钳记录显示vlPAG脑区一类神经元具有HCN通道电流特性。与假手术对照组相比较，CCI组大鼠术后14d vlPAG脑区神经元HCN电流显著增强，激活曲线向去极化偏移，神经元兴奋性增加。应用ZD7288阻断HCN通道后，神经元兴奋性显著降低。Biocytin标记显示所记录细胞位于vlPAG脑区。 5.胞内cAMP检测结果显示CCI组的vlPAG脑区cAMP水平显著高于假手术对照组。全细胞膜片钳记录显示正常大鼠脑组织孵育AC激动剂后升高胞内cAMP水平后vlPAG脑区神经元兴奋性显著增强，同时应用HCN通道阻断剂ZD7288后，神经元兴奋性回落至接近正常水平。结论： 1.神经病理性痛大鼠vlPAG脑区HCN1和HCN2通道表达水平发生改变，与神经病理性痛的发生及维持相关。 2.神经病理性痛大鼠vlPAG脑区Ih电流增强后参与调控神经元兴奋性改变，进而参与神经病理性痛的维持。 3.神经病理性痛发病过程中cAMP信号途径发挥重要的调控作用，cAMP通过调控vlAPG区某一类神经元HCN通道的功能，影响神经元兴奋性，使vlPAG发挥下行易化作用，参与神经病理性痛的发生及维持。 4.抑制vlAPG区HCN通道功能能够缓解神经病理性痛症状。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【图文】：

通道,大鼠

第三军医大学博士学位论文变化，Western blot 条带结果显示，大鼠 CCI 术后 14d，vlPAG 脑区 HCN1 N2 通道总蛋白表达水平均显著增加，通过 GAPDH 标准化后统计学比较发现照组及假手术组大鼠有显著差异 (HCN1: F(2,15)=300.01, p <0.001, HC)=358.31, p <0.001) (Figure 3)。荧光实时定量 PCR (Realtime-PCR) 技术进一I 后大鼠 vlPAG 脑区 HCN1 和 HCN2 通道 mRNA 的变化情况，结果显示：与组大鼠相比，模型组大鼠 CCI 术后 14d vlPAG 脑区 HCN1 和 HCN2 型通道 mR平显著升高 (p＜0.01，n=6) (Figure 4)。为了进一步检测 HCN1 和 HCN2 通lAPG 脑区神经元的表达分布特点，我们进行了免疫组织化学染色，免疫组化一步表明坐骨神经 CCI 手术后大鼠 vlAPG 脑区 HCN1 和 HCN2 通道阳性细高，半定量后与假手术组比较，具有统计学差异 (p＜0.01，n=6) (Figure 5)，荧光染色后激光共聚焦扫描发现，vlPAG 脑区神经元细胞膜 HCN1 通道和 H白表达均明显增高 (Figure 6)。

免疫组化检测,通道

图 5 免疫组化检测 CCI 术后 vlPAG 脑区 HCN1 通道和 HCN2 通道表达变化Figure 5 HCN1 and HCN2 expression are increased in vlPAG neurons after CCI surgerymmunohistochemical visualization of HCN1, 2 - immunoreactivities (IR) neurons in simultased CCI and sham vlPAG is shown. Note increases of HCN1- and HCN2- IR in CCI vlPAGranes. Histogram presents the mean numbers of HCN1, 2- IR neurons per section in vlPAG, rease in CCI than sham control. Scale bar, 100μm. (n = 6, * p < 0.05, compared to Sham con36

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