日本血吸虫童虫细胞免疫原及其模拟表位免疫学特性的研究

发布时间：2020-06-23 12:29

【摘要】： 第一章S.j童虫细胞不同大小和不同途径免疫小鼠抗攻击感染的研究目的观察三种品系小鼠对日本血吸虫(S.j)易感性及致病性的差异,比较S.j肝期童虫不同大小的细胞及肝期童虫混合细胞皮下和静脉注射两种免疫途径的保护性效果差异,探索不同发育期童虫细胞联合免疫提高保护性效果的可能性。方法KM鼠、NIH鼠、BALB/c鼠各10只,感染S.j尾蚴30±1尾/只,感染后第44d剖杀,观察各组小鼠的成虫发育率、肝卵数、肝卵肉芽肿及抗体应答水平;取S.j肝期童虫用剪切+冷消化法制备细胞,采用不同离心力将肝期童虫混合细胞分为大、中、小三类;取尾蚴热脱尾法收集皮肤期童虫,其中一部分培养96h后获取肺期童虫,两种童虫均用匀浆法制备细胞。保护性实验设计:取70只KM鼠,随机分组分为A(PBS对照)、B(HSMegCs)、C(HSMedCs)、D(HSMiniCs)、E(DSCs+PSCs+HSCs联合免疫)、F(HSCs-s.c.)和G(HSCs-i.v.)7组;免疫接种途径,除G组为尾静脉注射外,其余各组均为皮下多点注射;细胞接种量,均为2×10~6/0.1ml/次/鼠,每隔2w免疫1次,共免疫3次;末次免疫后2w攻击感染S.j尾蚴30±1尾/鼠,攻击后第44d剖杀,观察各组小鼠平均虫荷数,每克肝卵数(LEPG),每对虫肝卵数(LEPWP)、肝卵肉芽肿大小及血清特异性抗体水平。结果KM鼠、NIH鼠和BALB/c鼠体内S.j成虫发育率分别为69.23%,64.0%和50.33%,后者与前二者比较,有显著性差异(P＜0.05),前二者间比较,差异无显著性(P＞0.05);LEPG、LEPWP、肝卵肉芽肿及特异性抗体水平在三种小鼠间差异也无显著性(P＞0.05)。保护性实验结果显示:与A组相比,B组、C组、D组、E组、F组和G组的减虫率分别为15.08%、7.13%、16.4%、18.23%、31.02%和42.12%,LEPG减少率分别为14.56%、15.61%、13.53%、14.33%、41.61%和55.36%,LEPWP减少率分别为9.00%、8.38%、0.91%、0.15%、32.89%和27.84%。统计学分析表明,与A组相比,B组、C组、D组和E组的减虫率、LEPG减少率和LEPWP减少率的差异均无显著性(P＞0.05),而F组和G组的减虫率、LEPG减少率、LEPWP减少率及虫卵肉芽肿面积减少率的差异有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。F组和G组比较,减虫率和LEPG的差异有显著性(P＜0.01),但LEPWP及虫卵肉芽肿面积减少率的差异无显著性(P＞0.05)。结论KM鼠在对S.j易感性和致病性方面与NIH鼠,BALB/c无明显差异;S.j肝期童虫混合细胞采用静脉免疫途径的效果最佳;用不同大小的细胞免疫或不同发育期童虫细胞联合免疫的保护性效果不仅不能得到改善反而会降低。第二章S.j细胞型免疫原模拟表位的免疫学鉴定和保护性研究目的了解S.j童虫细胞免疫血清对噬菌体展示肽库进行亲和筛选所获得的模拟表位的免疫原性和免疫保护性效果。方法用S.j 12d童虫体外培养细胞免疫小鼠,获得具有抗攻击感染保护力的免疫血清并对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选;随机挑选20个克隆进行检测,并对15个阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析;将单个和混合阳性克隆分别免疫小鼠,用ELISA和Western blot鉴定阳性克隆的免疫原性及是否为血吸虫细胞免疫原的模拟表位;将含精氨酸残基克隆(PC-R)和不含精氨酸残基克隆(PC-NR)分别免疫KM鼠,同时设M13噬菌体免疫组和12d童虫细胞(SCs-12)免疫组,隔周免疫1次,共免疫3次,末次免疫后两周攻击感染S.j尾蚴40±1尾/鼠,攻击后第42d剖杀小鼠,计算各组虫荷和肝卵荷。结果15个阳性克隆经DNA测序和生物信息学分析显示其中有12个克隆具有完全不同的序列,且与已知日本血吸虫基因序列之间无同源性。12个克隆中有8个克隆含精氨酸残基。ELISA检测结果显示:SCs-12抗血清能与12个克隆中的11个发生反应;12个克隆的免疫鼠血清,除Clone-6,9外,均与JWA-12抗原呈阳性反应。Western blot显示Clone7,5,19,20免疫血清能识别JWA-12;保护性实验结果显示:与对照组相比,PC-R和PC-NR的减虫率和LEPG差异均有显著性(P＜0.01),PC-R和PC-NR两组间差异无显著性(P＞0.05)。结论噬菌体随机肽库筛出日本血吸虫童虫细胞抗原模拟表位,并可诱导小鼠产生一定的抗攻击感染效果。第三章S.j童虫细胞膜单克隆抗体的制备目的筛选鉴定出一种S.j童虫细胞膜的单克隆抗体,为血吸虫细胞生物学及免疫学研究提供工作基础和工具。方法感染家兔获取日本血吸虫肝门期童虫,用剪切+冷消化法制备细胞,用膜蛋白提取试剂盒提取血吸虫童虫细胞膜蛋白,然后用获得的膜蛋白腹腔注射免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,ELISA检测鼠血清中抗体水平达到1:4000,将小鼠在无菌条件下剖杀,取其脾细胞与预备的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,于96孔板中用含HAT和HT的培养基对融合细胞进行选择培养,用提取的膜蛋白抗原采用ELISA检测每孔培养细胞的上清是否含有阳性抗体,对阳性孔的细胞进行亚克隆培养并检测筛选,共进行了3次亚克隆培养与筛选。结果筛选所得到的阳性克隆在亚克隆的过程中细胞逐渐死亡或者转为阴性细胞,最后实验失败,未获得单克隆细胞株。结论未能制备出稳定分泌针对S.j童虫细胞膜抗原的单克隆抗体,可能与SP2/0细胞突变有关。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392
【图文】：

品系,血吸虫抗原,小鼠,KM鼠

图Figl一32.3特异性抗体水平差异用间接ELISA法检测三种小鼠不同时点血清中抗HSSAgIgG抗体水平结果见表卜4和图卜4。由表中可看出，IgG水平在成虫期上升的最快，三种小鼠之间的IgG水平在各时点无明显差异，说明KM鼠对血吸虫抗原刺激后的免疫应

时点,感染后,品系,小鼠

Flgurel礴anti、 HSSAgIgGlevelofthreestrainmieeatdifferentt如 eafterinfection2.4Sj童虫细胞免疫原形态、活力和种属鉴定收集的皮肤期和肺期童虫细胞的虫体图片见图1一5。皮肤期童虫和肺期童虫经研磨洗涤离心得到细胞，肝期童虫经机械剪切和胰酶消化后，洗涤离心得到细胞，如图1一6所示，细胞绝大多数呈圆形，表面光滑，饱满，轮廓清晰，有清晰的胞核和核仁，细胞间杂质少。AO一EB染色显示细胞活力在90%左右，见图1一7。

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