高压氧对脑缺血再灌注小鼠血脑屏障通透性的影响

发布时间：2020-06-24 13:38

【摘要】： 目的血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)是由内皮细胞的紧密连接，基膜及星形胶质细胞组成一个位于脑和微血管之间的物质调节界面，对进出的物质具有选择性通过作用。血脑屏障的破坏是脑缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)脑损伤的重要的病理生理基础。脑缺血再灌注早期，伴随着细胞因子，粘附分子的表达，特别是促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8使缺血性损伤向炎症性损伤转变，其中抑制因子IL-10在IR损伤中也起到抵抗炎症反应的作用。炎症和免疫反应在脑缺血再灌注的病理生理中起重要作用，包括白细胞浸润，巨噬细胞激活等。白细胞激活后产生大量的蛋白水解酶，氧自由基和其他效应分子，导致脑毛细血管内皮细胞及其基底膜损害，破坏BBB的完整性，导致BBB的通透性增加。高压氧(hyperbaric oxygenation，HBO)作为治疗缺血性脑血管疾病中的一种非创伤性手段在临床上正得以应用。它具有改善组织缺氧，维持细胞能量代谢，减轻脑水肿作用，但HBO在脑缺血再灌注损伤中对血脑屏障通透性的影响研究甚少，本研究从细胞水平，分子水平，基因水平进一步探讨高压氧在脑缺血再灌注损伤中对血脑屏障通透性的影响，为临床上应用高压氧治疗缺血性脑血管疾病提供有力的实验依据。方法 1．脑缺血再灌注模型的复制：采用清醒小鼠颈部手术分离双侧颈总动脉，用橡皮泥固定拉紧丝线，阻断双侧颈总动脉血流30分钟，松线后，无菌缝合颈部皮肤。假手术组与HBO组只作颈部手术，不阻断颈总动脉血流。 2．实验鼠的高压氧处理：高压氧组与高压氧+脑缺血再灌注组于术后2h、9h、21h、45h、69h进入HBO舱内，待动物进舱后，先用纯氧洗舱10分钟，使舱内O_2浓度＞90％，加压速率为0.0125MPa／min，加压至0.25MPa，在高压氧状态下停留60分钟，其间用纯氧通气10分钟。停留毕，以20分钟匀速减至常压。 3．脑皮质血流检测：用激光多普勒血流仪监测脑皮质血流，打开颅腔，选择测定脑血流，于缺血前、缺血10分钟在0分钟J0分钟，再灌注4 ／J’时J ／J’时在3 ／J’时A8 ／J’时J72小时分别测定脑皮质血流值。 4．组织依文思兰门vans blue，EB）定量测定：参考 Udaka K．法。在处死动物前 1／J’时经尾静脉注射 2％Evans兰，在检测前20分钟进行在体心脏灌注，直至心房流出清亮的液体为准。术后4 小时＊二小时上3小时／8小时 J72小时处死小鼠，摘取脑组织用电子天平精确秤其湿重后，投入中号试管中，分别加人 3 ml甲酚胺，加盖后于 45℃的水浴箱孵育48h，轻轻摇匀，离心 15min门000r／min入取上清液在722型光栅分光光度计比色h＝632urn八 5．ABC－ELISA法检测细胞因子的含量：术后72小时处死小鼠于冰盘上快速剥离脑部组织，以冰冷的PBS冲洗，滤纸吸干，立即于电子天平秤重，配成 10％脑组织匀浆，匀浆液于 4T 4000r／ndn离心15分钟，取上清液，采用双抗体夹心ABC－ELISA法在波长 492urn处检测 IL－16＼TNFa、IL－6、IL－8、IL－10的含量。 6．明胶酶谱法活力测定：取海马区的脑组织经匀浆离心制成蛋白质抽提液，取ZOUI上样于含 sing／Inl明胶的聚丙烯酚胺凝胶中，20mA恒流电泳，电泳后，将凝胶于 2． 5％的TitonX－100液内振荡37℃，1／J’时，酶缓冲液K，PH7． 5；200mmoUINaCI；500nunol／ICaCI。呐乒育 37℃，42小日。多育结束后经染色液”．05％考马斯亮蓝乃0％甲醇＊0％乙酸）染色3小时，及脱色液A。 B人（甲醇浓度为30％上0％J0％；乙酸浓度分别为10％＊0％J％）分别脱色0．5、l上／J’时显示出MMP－2和MMP－9位于蓝色背景上的透亮带。 7．抗氧化酶类（GSH－PX3OD人AT）及NOS活性和丙二醛（MDA）含量的测定：于再灌注72小时处死小鼠，于冰盘上取海马区的脑组织，置匀浆管中，加人预冷的生理盐水若干毫升，用匀浆器制成10％的匀浆，用台式高速离心机LJ 10000r／min离心 smin取上清液。用 NOS、GSH－PX、SOD。 CAT、MDA测试盒分别在入二530urn、入＝412urn、入＝550urn、入＝405urn及A 二 532urn处检测酶活性及丙H醛的含量。 8．RT－PCR法检测脑组织中细胞因子的表达 ·2· 8l 脑组织总RNA抽提：同异硫氰酸肥‘一步法”提取。取海马区脑组织0．1克量／rnl TRIzol中于冰上匀浆后，放置10min，取上清加氯仿 200ul，轻摇混匀，4℃离心 10000rpln／min 15min后，取上清液加 500rpl异丙醇，室温下放置 15min，4℃离心 12000rpln／min 15min，弃上清加乃％乙醇 IM，4℃离心12000rpndmin 15min。室温干燥，加无RNA酶水溶解。电泳扫描检测RNA含量，置－70℃保存。 8．2 RT—PCR反应：采用 RT－PCR法对脑缺血再灌注小鼠几－16、TNFa、IL－6、IL－8、IL 叫0的mRNA的表达水平进行检测及半定量分析。弓物序列女下： IL－二 p：PI：5’－GAGA’ITG！＼GCTGTCTGCT－3’， PZ：5’－AAGGAGAACCAAGCAACGAC—3二313 hp， TNFa：PI：5’－CAGATI’GACCTCAGCG
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R363
【图文】：

神经,线粒体,内胞浆,脑缺血再灌注

线粒体晴断裂。Fi妙Eleetronmieroseopie沮showinIR卿up3.2HBO十脑缺血再灌注组与脑缺血的再灌注组相比(见图5)神经元坏死不明显，胶质细胞内胞浆淡染，胞核明显，线粒体结构清晰，峪明显。

【参考文献】