基于TALEN及CRISPR技术的基因敲除大鼠及小鼠模型的构建

发布时间：2020-06-24 22:56

【摘要】：基因敲除动物模型对于了解生命活动的机制,疾病的机理以及药物的筛选有着重大的意义。得益于和人类生理和遗传上的相似性,以及基于干细胞内同源重组的基因敲除技术的出现,近几十年来基因敲除小鼠模型在生物医学研究中起着举足轻重的作用。与小鼠相比,大鼠更适合模拟人类的一些疾病,以及进行营养学,毒理和行为学的研究。然而受制于大鼠干细胞培养条件的苛刻性,近几十年在基因操作领域的进展大幅落后于小鼠。即便对于小鼠,由于传统干细胞基因打靶技术其内在的复杂性,也存在费时,困难,工作量大的问题,难以满足日益增长的科研需求。随着最近对黄单胞菌属植物致病菌致病机理的破解,以及对细菌和古细菌抵抗噬菌体感染等外来遗传物质侵袭机制的揭示,基于转录激活因子样效应蛋白(transcription activator-like effector)的人工核酸酶TALEN (transcription activator-like effector nuclease)和改造自细菌获得性免疫机制的CRISPR/Cas系统作为一种富有潜力的基因编辑工具进入了人们的视线。为了证实以上技术是否能用于基因敲除大鼠及小鼠模型的构建,我们针对位于8个染色体上共10个不同的小鼠基因,设计和组装了相应的TALEN表达质粒,并通过将体外转录的TALEN mRNA显微注射入小鼠受精卵。测序结果显示,以上10个基因均成功获得了突变体首建小鼠。新生小鼠中突变体小鼠的比例从13%到67%不等,平均突变效率约为40%。来自C57BL/6与FVB两种不同遗传背景的小鼠,在突变效率上没有出现明显的不同。所有进行生殖系转移能力测试的小鼠均能有效的将突变传递给子代小鼠。其中瘦素受体基因发生双等位基因突变的F0代小鼠表现出了与之前报道相一致的肥胖和糖代谢紊乱等症状。另外我们通过向小鼠及大鼠受精卵细胞显微注射体外转录的Cas9 mRNA及靶点特异性guideRNA,证实CRISPR/Cas技术能够在小鼠胚胎中产生高效的定点突变,并且没有小鼠遗传品系的限制。通过同时靶向Uhrf2基因两个临近的靶点,表明CRISPR-Cas系统能够对大片段的基因组DNA进行删除。通过在大鼠受精卵细胞注射针对Mc4r与Mc3r两个不同基因的guideRNA,实现了在同一只大鼠中产生两个基因突变的效果,且得到的Mc4r基因敲除大鼠与ENU化学诱变法构建的同一基因突变大鼠相比具有一致的表型。通过对Th和Rheb基因两种不同类型的潜在脱靶位点进行测序表明,CRISPR-Cas系统在小鼠体内具有较高的靶点特异性。生殖系转移测试表明CRISPR-Cas造成的基因突变无论在大鼠还是小鼠中都能够有效的遗传给下一代。综上所述,我们认为TALEN和CRISPR系统可以作为继干细胞基因打靶与锌指核酸酶之后,更为优越的基因敲除大、小鼠动物模型构建技术。能够大大降低上述基因敲除动物模型构建的难度,费用,周期,将极大的推动基因敲除动物模型在生物医学研究中的应用
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q78;R-332

【参考文献】