麻疹病毒血凝素蛋白与受体的相互作用及麻疹病毒侵染机制研究

发布时间：2020-07-04 11:28

【摘要】：麻疹病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin protein，H)是介导麻疹病毒吸附、侵入宿主细胞的关键分子。CD46是被鉴定的麻疹病毒的第一个受体。我们从分离得到的麻疹病毒野毒株中发现了决定麻疹病毒血凝集性转变的关键位点，即和CD46相互作用的关键位点；进一步研究了H蛋白对CD46的调控。人细胞表面的SLAM(signaling lymphocytic activation molecule)分子是2000年鉴定的麻疹病毒的第二受体。2001年，本室李凌云博士从绒猴B95a细胞cDNA文库中发现了与SLAM高度同源的蛋白BIP，并且验证了它也能作为麻疹病毒的受体，我们称为mSLAM。为了进一步研究麻疹病毒第二受体SLAM(或mSLAM)在麻疹病毒侵染宿主过程中的作用，我们着重分析了麻疹病毒H蛋白和SLAM的相互作用。在本文研究结果和前人研究的基础上，提出了麻疹病毒侵染宿主的可能机制。首先我们确定了决定麻疹病毒血凝集性转变的关键位点：将来源于B95a细胞系、血凝集性为阴性的麻疹病毒株H基因进行位点专一性突变(即专一性的将H基因的第1441位的A突变为T、相应于H蛋白的第481位由Asn突变为Tyr；第1636位的A突变为G，相应于H蛋白的第546位由Ser突变为Gly)，并在COS-7细胞中表达含单点突变的H基因。在COS-7细胞表面表达的突变H蛋白能够凝集非洲绿猴红细胞(AGM-RBC)，且这种凝集作用可以被CD46分子的特异性抗体M75完全阻断，从而证实这种凝集作用是通过突变H蛋白与CD46的相互结合实现的，即单点突变的H蛋白(氨基酸第481位为Tyr或第546位为Gly)能够与CD46受体结合，并导致AGM-RBC的凝集。证明H蛋白第481位和第546位氨基酸是决定其与CD46结合及血凝集性的重要位点，该位点的突变能够改变H蛋白与CD46受体结合的能力，并导致血凝集性表型的改变。文献报道指出，麻疹病毒H蛋白在细胞膜上的表达，以及被麻疹病毒感染的细胞和未感染细胞的直接接触能够引起其受体CD46的表达下调。这里我们应用实时定量Rl飞PCR的方法检测了CD46的mRNA水平在麻疹病毒感染细胞内的变化，发现其mRNA水平无明显改变。为了进一步研究CD46在麻疹病毒感染细胞内的表达情况，我们用流式细胞技术和间接免疫荧光技术检测了CD46蛋白表达。根据我们的实验结果得出如下结论:用麻疹疫苗株S一191感染HeLa细胞后，CD46的表达在mRNA水平和细胞表面的蛋白水平均未被下调。以往的研究之所以提出CD46分子被麻疹病毒的感染所“下调”，我们认为是由于H蛋白在和CD46分子结合后，封闭了CD46抗体与CD46的结合位点，从而导致了CD46 分子被“下调”的假象。采用PCR技术，我们构建了一系列缺失突变的SLAM分子:缺失跨膜区和胞内区;缺失N端信号肤;缺失C端;缺失N端。将这一系列缺失突变体分别克隆到酵母表达载体pGAD424中，同时将麻疹病毒H基因克隆到酵母表达载体pGBTg 中。利用酵母双杂交系统分析缺失突变的SLAM和H蛋白在酵母中的相互作用。结果表明:SLAM分子上与H蛋白起关键作用的部位是N端27一135位氨基酸;SLAM 分子N端信号肤的缺失不影响其与H蛋白在酵母中的相互作用;SLAM分子的胞内区和跨膜区对其与H蛋白的结合没有贡献;SLAM分子C端(136一227位氨基酸) 的缺失不影响其与H蛋白在酵母中的相互作用。在初步确定SLAM分子上的27一135位氨基酸序列是与H蛋白作用的主要部位后，我们将该序列克隆到原核表达载体pRSET中进行表达纯化。用纯化后的SLAM 多肤27一135筛选噬菌体展示文库，得到了6个与该多肤有高度亲合力的短肤。对这些短肤进行序列分析发现，有2个短肤的氨基酸序列与H蛋白429一438位氨基酸序列很相似。由于这些短肤既与SLAM有高度亲和力，又与H蛋白有序列上的相似性，提示H蛋白429一438位氨基酸序列可能在H蛋白与SLAM的相互作用中扮演重要角色。我们进一步证实这些短肤能与H蛋白竞争结合SLAM，并且能够阻止麻疹病毒侵染宿主细胞。结果显示:一方面这些短肤有望开发成麻疹病毒侵染阻断剂，另一方面H蛋白429~438位氨基酸序列可能是介导H和SLAM相互作用的关键部位，为进一步研究H蛋白与SLAM的相互作用提供了理想的切入点。采用位点特异性突变技术，我们对H蛋白429一438位氨基酸序列进行了单点突变和多点突变，利用免疫共沉淀技术研究了突变后的H蛋白在真核细胞内的表达情况以及突变后的H蛋白与SLAM在真核细胞内的结合情况。结果表明:H蛋白上的429位Ser突变为Ala以及436位Thr和437位His突变为Ala后，H蛋白丧失了与SLAM在真核细胞中结合的能力。提示H蛋白上的429位Ser、436位 Thr和437位HIS是H蛋白与SLAM分子相互作用的重要位点，尽管目前还不能确定这些氨基酸的作用是因为其本身的理化性质改变影响了H蛋白的结构还是由于其直接参与构成了H上与SLAM结合的活性部位。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R373
【图文】：

序列,麻疹病毒,结式

1.1.1麻疹病毒基因组结构麻疹病毒基因组为非片段化(non-segmented)的单股负链RNACss卿A)。基因组全长约为16000个核昔酸，其基因组结构模式如图2所示【Hin~M.R.，2002]。麻疹病毒有6个结构基因，对应编码6个主要结构蛋白。其中P基因可以编码三个蛋白:P、e、v少a切山oM，2000]。麻疹病毒的基因组组成与其他副粘病毒科的病毒很相似:3’端52个核昔酸为前导子(Leader)，接着是基因间间隔区3’GAAS‘，接下来几乎每一个基因间间隔区都有GAA序列，只有H基因与L基因的间隔区为3‘GcAS’[crowteyetal.1988]。每个基因的起始序列和终止序列中都存在共有序列(consensussequences)，其功能可能是mRNA合成和加工的信号。同时还有一个由36个核昔酸组成的5‘尾部。麻疹病毒标准毒株Edmonst。n(Edm)的全基因组序列已被测定「Galinski

麻疹病毒,结构模式,抗原性漂移,麻疹

al.，1994](见图3)。研究显示，由于麻疹野毒株H基因的变异导致了病毒出现抗原性漂移(antigeniedrift)[Hu们nrnelK.B.，1995」。图3麻疹病毒血凝素蛋白结构模式图〔PlemperR.K.，2000]

【引证文献】