体外岩藻糖基化修饰细胞表面CD44分子促进人脂肪来源干细胞体内迁移成骨的实验研究

发布时间：2020-07-07 08:02

【摘要】：目的： 1.建立体外分离、培养、获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)的方法,并对其形态、免疫表型、生物学特性进行观察和研究。 2.建立体外分离培养获得人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的方法,并对其形态、生物学特性进行观察和研究。 方法： 1.抽脂术获得大量脂肪,用0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得大量人脂肪间充质干细胞行并进行体外培养。在倒置显微镜下观察其细胞形态特征；用CCK-8细胞增殖试验绘制生长曲线；用流式细胞仪检测细胞表面间充质干细胞相关抗原；并分别进行成骨、成脂诱导分化鉴定其多向分化潜能。 2.将获取的新鲜胎儿脐带使用0.2%Ⅰ型胶原酶消化法获得大量脐静脉内皮细胞行并进行体外培养。在倒置显微镜下观察其细胞形态特征,并通过DiI-Ac-LDL摄取实验进行鉴定。 结果： 1.通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的成纤维样细胞。CCK-8法显示细胞增殖能力强。流式鉴定结果显示细胞表面CD2、CD44阳性；CD45、HLA-DR阴性。培养的细胞在特定诱导条件下,具有向骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。证明该方法所培养的细胞为脐静脉内皮细胞。 2.通过分离培养,获得了大量鹅卵石样细胞。荧光显微镜下观察其具有摄取DiI-Ac-LDL的能力,证明该方法所培养的细胞为脐静脉内皮细胞。 结论： 建立了高效稳定的分离、培养人脂肪间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的方法,为后续实验提供了种子细胞。 目的： 通过应用糖基化工程,体外岩藻糖基化处理人脂肪间充质干细胞(hASCs),将其表面的CD44分子转换为HCELL分子,从而提高hASCs与E选择素结合能力,为功能研究及体内研究奠定基础。 方法： 建立α-1,3-岩藻糖基转移酶以及相应底物的酶化体系。使用流式细胞仪检测1ASCs表面粘附因子的表达情况。将岩藻糖基化处理后的]ASCs进行体外功能试验,包括流式细胞技术、免疫印迹技术、静态及动态粘附试验,验证其唾液酸化LewisX (sLex)的表达及具有E选择素结合能力。并使用台酚蓝染色法、CCK-8法、诱导分化检测岩藻糖基化处理是否影响细胞的增殖、活性及多向分化能力。 结果： 流式结果显示未处理的hASCs高表达CD29、CD44、CD49d、CD49e,低表达或者不表达唾液酸化LewisX (sLeX)、PSGL-1、CXCR4、β7,无E选择素结合力。然而,经过体外岩藻糖基化处理后的hASCs高表达sLex,E选择素结合力显著升高。免疫印迹法也证实了这一结果。静态及动态粘附实验均证明与未处理组相比,岩藻糖基化处理后的hASCs在静态及动态条件下,对E选择素结合力显著升高。同时,我们还证实了岩藻糖基化处理不会影响细胞的增殖、活性及多向分化能力。 结论： 岩藻糖基化处理后的hASCs高表达sLex,并显著增加E选择素结合力,并不会影响细胞的增殖、活性及多向分化能力。 目的：通过体外岩藻糖基化处理hASCs,使其表面强制表达HCELL分子,从而提高hASCs的E选择素结合能力,最终促进其向骨归巢能力。 方法： 1.将DiI荧光标记过的岩藻糖基化处理后hASCs通过尾静脉回输至NOD/SCID小鼠体内,16小时后将处死小鼠,取得股骨骨髓,通过流式细胞术检测DiI阳性细胞所占比例。 2.将岩藻糖基化处理后hASCs通过尾静脉回输至NOD/SCID小鼠体内,3个月后将小鼠处死,取出颅骨脱钙,OCT包埋,制成冰冻切片。运用免疫荧光法检测归巢ASCs的定植位置及成骨分化能力。 结果： 1.流式细胞术的结果显示：岩藻糖基化处理组的骨髓内DiI染色阳性细胞的所占比例约为0.77+0.10%；未处理组的骨髓内DiI染色阳性细胞的所占比例约为0.09+0.02%。上述结果表明,岩藻糖基化处理可以显著提高hASCs的短期归巢能力。 2.通过共聚焦显微镜观察到的免疫荧光结果显示：岩藻糖基化组的小鼠颅骨骨内膜表面可以观察到稀少的人骨钙素阳性的成骨细胞,而在未处理组及对照组均未发现人骨钙素阳性的细胞。上述结果证明经过岩藻糖基化处理后的hASCs不仅能够促进其向骨归巢能力,并仍能保留其向成骨分化的能力。 结论： 岩藻糖基化处理可以显著提高hASCs在NOD/SCID小鼠体内的向骨归巢能力,并定植于骨内膜表面,仍具有自我更新及成骨分化能力。这为为其在组织再生修复中进一步的实际应用奠定基础。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【图文】：

约10-14d后细胞长满瓶底80%左右时，此时可进行细胞传代。传代后的hASCs呈分布均一的长梭形(图1)。 , ^ -差_图1第三代人脂肪间充质干细胞(xioo)Figl The third generation hASCs(xlOO)2.2 hASCs的细胞生长动力学检测CCIC-8结果示，hASCs传代培养后第2天细胞进入指数增殖期，第4天进入平台期18

流式结果显示：hASCs高表达CD29、CD44、CD49d、CD49e，低表达或者不表达唾液酸化LewisX (sLeX)、PSGL-1、CXCR4、P 7,无E选择素结合力(图9)。. E-lg 5 丨 CSLEX.1 5, CD44A 丨/\ A 1\I / \ ： j \ N {\) \ \J\ n i\? ‘ ?‘ . V f <t' f ,?■ ??? *4? 'V ' * ‘ "?‘ “ St"s PSGL-1 -- CXCR4 J CD29-? . . hI i\\ \

本文编号：2744865