细胞外钙敏感受体在缺氧性肺血管收缩中的作用和机制

发布时间：2020-07-10 13:35

【摘要】：第一部分细胞外钙敏感受体在缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞胞浆钙浓度增加中的作用和机制 目的：研究细胞外钙敏感受体(extracellular calcium-sensing receptor, CaSR)在缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞胞浆内钙离子浓度([Ca2+]i)增加中的作用及机制。 方法：原代培养SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs);免疫组织化学染色和western blot检测PASMCs上CaSR的表达情况；用不同浓度的细胞外Ca2+处理PASMCs检测CaSR功能；用钙离子荧光探针Fura-2/AM和荧光成像系统检测[Ca2+]i;用H2-DCFDA和mito-RoGFP检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成；shRNA基因技术干扰CaSR、STIM1和RyR3的表达,并用western blot检测干扰效率。 结果：(1)免疫组织化学染色和western blot均检测到PASMCs细胞膜和胞浆CaSR表达,western blot结果显示细胞膜和胞浆中CaSR的分子量分别为55-72kD和170kD左右。(2)用4、6、7.5mM细胞外Ca2+处理PASMCs,可诱导ERKl/2磷酸化水平逐渐增强,同时6mM和7.5mM细胞外Ca2+又可以引起[Ca2+]i显著增高,而此效应可被CaSR特异性阻滞剂Calhex231所抑制。(3)缺氧可诱导PASMCs ROS产生增加,用外源性H202校正并模拟,缺氧诱导ROS产生相当于15.6μM H2O2诱导ROS的产生。(4)缺氧以及15.6μM H2O2均能引起PASMCs [Ca24]i升高,同时Calhex231和shRNA-CaSR能抑制缺氧以及15.6μM H2O2引起的[Ca2+]i升高。(5)线粒体DNA剔除不仅抑制缺氧引起的ROS生成增多,也抑制缺氧引起的[Ca2+]i增加,这种效应能被外源性15.6μM H2O2所逆转,Calhex231和shRNA-CaSR又能够阻止H202对上述反应的逆转作用。同时PEG-catalase预处理PASMCs能够抑制缺氧引起的[Ca2+]i增加,而PEG-SOD预处理则无此作用。(5)100μM ryanodine抑制RyR功能,可以减弱缺氧和15.6μM H2O2引起的[Ca2+]i升高,但是IP3R的抑制剂20μM XeC却无此作用；若同时应用PKA抑制剂H-89,则100μM ryanodine不再抑制缺氧和H202引起的[Ca2+]i增加,20μM XeC却可以抑制此反应。储库操纵性钙离子进入(store-operated Ca2+entry, SOCE)抑制剂50μM SKF96365可显著抑制缺氧和15.6μM H2O2引起的[Ca2+]i升高。此外,STIM1和RyR3基因敲除也可减弱缺氧和H202引起的[Ca2+]i升高。结论：缺氧刺激引起PASMCs线粒体源性H202产生增加,增加的H202可以使CaSR敏感性增强,从而被细胞外Ca2+激活,进而引起RyR敏感性钙通道开放,钙库Ca2+释放,并激活SOCE,通过STIM1介导细胞外Ca2+内流,共同造成[Ca2+]i升高。 第二部分细胞外钙敏感受体在离体和在体缺氧性肺血管收缩中的作用 目的：探讨CaSR在离体和在体缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction, HPV)中的关键作用。 方法：慢病毒感染SD大鼠,下调CaSR蛋白表达；Power lab四导仪监测离体肺动脉张力及大鼠在不同条件下肺动脉压和心输出量。 结果：(1)将慢病毒包装的CaSR特异性干扰质粒,从SD大鼠尾静脉注射72小时后,western blot检测CaSR蛋白表达水平明显下降。(2)离体实验中,缺氧和15.6μM H2O2均能引起肺血管张力增加,同时Calhex231能抑制缺氧以及15.6μM H2O2引起肺血管张力增加。此外,shRNA-CaSR可以抑制缺氧引起的肺血管张力增加。(3)在体实验中,缺氧可以引起SD大鼠肺动脉压力明显增加,同时Calhex231和shRNA-CaSR能抑制缺氧刺激引起的肺动脉压力增加。 结论：CaSR介导缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的升高,最终导致缺氧性肺血管收缩和肺动脉高压。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

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